1. Uelewa wa awali

Katika hatua hii, tunahitaji kuelewa baadhi ya dhana na istilahi, ili kuepuka kufanya makosa mbele ya wazee wetu, kama vile:

Swali: Kuna tofauti gani kati ya RT-PCR, qPCR, PCR ya wakati Halisi, na RT-PCR ya wakati halisi?

Jibu: RT-PCR ni PCR ya unukuzi wa kinyume(reverse transcription PCR, RT-PCR), ambayo ni lahaja inayotumika sana ya polymerase chain reaction (PCR).Katika RT-PCR, uzi wa RNA hunakiliwa kinyume hadi DNA ya ziada, ambayo hutumika kama kiolezo cha ukuzaji wa DNA na PCR.
PCR ya wakati halisi na qPCR(Quantitative Real-ltime-PCR) ni kitu kimoja, zote mbili ni muda halisi wa kiasi cha PCR, ambayo ina maana kwamba kila mzunguko wa PCR una rekodi za data za muda halisi, hivyo idadi ya violezo vya kuanzia inaweza kubadilishwa uchambuzi sahihi.

Ingawa PCR ya Wakati Halisi (PCR ya umeme wa wakati halisi) na unukuzi wa Reverse PCR (reverse transcription PCR) zinaonekana kufupishwa kama RT-PCR, mkataba wa kimataifa ni: RT-PCR inarejelea unukuzi wa kinyume.PCR , PCR ya wakati Halisi kwa ujumla inafupishwa kama qPCR (PCR ya muda halisi ya kiasi).

Na RT-PCR ya wakati halisi (RT-qPCR), Ni unukuzi wa nyuma wa PCR pamoja na teknolojia ya upimaji wa umeme.: kwanza pata cDNA (RT) kutoka kwa unukuzi wa kinyume cha RNA, kisha utumie PCR ya Wakati Halisi kwa uchanganuzi wa kiasi (qPCR).Maabara nyingi hufanya RT-qPCR, ambayo ni, utafiti juu ya udhibiti wa chini wa kujieleza kwa RNA, kwa hivyo qPCR ambayo kila mtu anazungumza juu yake kwenye maabara inarejelea RT-qPCR, lakini usisahau kwamba bado kuna vipimo vingi vya DNA katika matumizi ya kliniki.Uchambuzi wa kiasi, kama vile kugundua virusi vya hepatitis B HBV.

Swali: Baada ya kusoma PCR nyingi za kiasi cha fluorescent, kwa nini kipande kilichoimarishwa kidhibitiwe ndani ya masafa ya 80-300bp?

Jibu: Urefu wa kila mlolongo wa jeni ni tofauti, baadhi ni kb kadhaa, baadhi ni mamia ya bp, lakini tunahitaji tu kuhitaji urefu wa bidhaa kuwa 80-300bp wakati wa kuunda vianzio, vifupi sana au virefu sana havifai kwa utambuzi wa kiasi cha umeme wa PCR .Kipande cha bidhaa ni kifupi sana kuweza kutofautishwa kutoka kwa primer-dimer.Urefu wa primer-dimer ni kuhusu 30-40bp, na ni vigumu kutofautisha ikiwa ni primer-dimer au bidhaa ikiwa ni chini ya 80bp.Ikiwa kipande cha bidhaa ni kirefu sana, kinazidi 300bp, kitasababisha ufanisi wa chini wa ukuzaji na haiwezi kutambua kwa ufanisi kiasi cha jeni.

Kwa mfano, unapohesabu ni watu wangapi darasani, unahitaji tu kuhesabu ni midomo mingapi.Vile vile ni kweli unapogundua jeni, unahitaji tu kugundua mlolongo fulani wa jeni ili kuwakilisha Mlolongo mzima utafanya.Ikiwa unataka kuhesabu watu, unahitaji kuhesabu midomo na pua zote mbili, masikio, na glasi, na ni rahisi kufanya makosa.

Ili kupanua, katika utafiti wa kibaolojia, kuna kesi nyingi za utafiti kutoka sehemu hadi eneo, kwa sababu mlolongo wa jeni wa spishi yoyote ni ndefu sana, sio lazima na haiwezekani kupima vipande vyote, kama vile mpangilio wa 16S wa bakteria, ambayo ni kutekeleza mlolongo wa kihafidhina wa Uchunguzi wa bakteria ili kuashiria idadi ya idadi fulani ya bakteria.

Swali: Je, ni urefu gani unaofaa zaidi wa muundo wa kitangulizi cha qPCR?

Jibu: Kwa ujumla, urefu wa primer ni karibu 20-24bp, ambayo ni bora zaidi.Bila shaka, ni lazima tuzingatie thamani ya TM ya primer wakati wa kubuni primer, kwa sababu hii inahusiana na joto mojawapo la annealing.Baada ya majaribio mengi, imethibitishwa kuwa 60 ° C ni thamani bora ya TM.Ikiwa halijoto ya annealing ni ya chini sana, itasababisha kwa urahisi ukuzaji usio maalum.Ikiwa halijoto ya annealing ni ya juu sana, ufanisi wa ukuzaji utakuwa chini kiasi, kilele cha curve ya ukuzaji kitaanza baadaye, na thamani ya CT itachelewa.

Swali: Je, njia ya rangi ni tofauti gani na njia ya uchunguzi?

Jibu: Njia ya rangiBaadhi ya rangi za fluorescent, kama vile SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, n.k., hazitoi mwanga zenyewe, lakini zitatoa mwanga wa umeme baada ya kushikamana na mkondo mdogo wa DNA yenye nyuzi mbili.Kwa hiyo, mwanzoni mwa mmenyuko wa PCR, mashine haiwezi kuchunguza ishara ya fluorescent.Wakati mmenyuko unafikia hatua ya upanuzi wa annealing, strand mbili inafunguliwa, na strand mpya inaunganishwa chini ya hatua ya DNA polymerase, na molekuli ya fluorescent hufunga kwa dsDNA Groove ndogo.Kadiri idadi ya mizunguko ya PCR inavyoongezeka, rangi zaidi na zaidi huunganishwa na DNA yenye nyuzi mbili, na ishara ya umeme pia inaimarishwa kila mara.Njia ya rangi hutumiwa hasa katika utafiti wa kisayansi.
PS: Kuwa mwangalifu wakati wa kufanya majaribio, rangi inapaswa kuunganishwa na DNA ya binadamu, kuwa mwangalifu kuigeuza kuwa mtu wa fluorescent.

Mbinu ya kupaka rangi (kushoto) Mbinu ya kuchunguza (kulia)
PS: Kuwa mwangalifu wakati wa kufanya majaribio, rangi inapaswa kuunganishwa na DNA ya binadamu, kuwa mwangalifu kuigeuza kuwa mtu wa fluorescent.

SYBR Green Ⅰ hufungamana na kijito kidogo cha DNA

Mbinu ya uchunguziUchunguzi wa Taqman ndio uchunguzi unaotumika sana wa hidrolisisi.Kuna kikundi cha fluorescent kwenye mwisho wa 5′ wa uchunguzi, kwa kawaida FAM, na uchunguzi wenyewe ni mfuatano wa jeni lengwa.Kuna kikundi cha kuzima umeme mwishoni mwa 3′.Kulingana na kanuni ya uhamishaji wa nishati ya mwanga wa umeme (Förster resonance energy transfer, FRET), wakati mwandishi wa kikundi cha fluorescent (molekuli ya fluorescent ya wafadhili) na kikundi cha fluorescent inayozima (molekuli ya umeme ya kupokea) husisimka Wakati spectra inapoingiliana na umbali ni karibu sana (7-10 nmsisimko wa molekuli ya wafadhili hukubali molekuli ya fluorescent). , wakati autofluorescence ni dhaifu.Kwa hiyo, mwanzoni mwa mmenyuko wa PCR, wakati probe ni bure na intact katika mfumo, kikundi cha fluorescent cha mwandishi hakitatoa fluorescence.Wakati wa annealing, primer na probe hufunga kwa template.Wakati wa hatua ya ugani, polimasi huendelea kuunganisha minyororo mipya.DNA polymerase ina shughuli ya 5'-3′ ya exonuclease.Inapofikia uchunguzi, polimerasi ya DNA itahamisha uchunguzi kutoka kwa kiolezo, kutenganisha kikundi cha ripota cha fluorescent kutoka kwa kikundi cha quencher fluorescent, na kutoa mawimbi ya umeme.Kwa kuwa kuna uhusiano wa moja kwa moja kati ya uchunguzi na template, njia ya uchunguzi ni bora kuliko njia ya rangi kwa suala la usahihi na unyeti wa mtihani.Njia ya uchunguzi hutumiwa hasa katika utambuzi.

Swali: Ukadiriaji kamili ni nini?Ukadiriaji wa Jamaa ni nini?

Jibu: Ukadiriaji kamili unarejelea hesabu ya nambari ya nakala ya awali ya sampuli itakayojaribiwa na qPCR, kama vile ni virusi ngapi vya HBV vilivyo katika 1ml ya damu.Matokeo yanayopatikana kwa ukadiriaji jamaa ni mabadiliko ya kiasi cha jeni lengwa katika sampuli mahususi inayohusiana na sampuli nyingine ya marejeleo, na usemi wa jeni umedhibitiwa juu au chini-udhibiti.

Swali: Je, kiasi cha uchimbaji wa RNA, ufanisi wa unukuzi wa kinyume, na ufanisi wa ukuzaji utaathiri matokeo ya majaribio?
Swali: Je, uhifadhi wa sampuli, vitendanishi vya uchimbaji, vitendanishi vya unukuzi vya kinyume, na vifaa vinavyopitisha mwanga vitaathiri matokeo ya majaribio?
Swali: Ni njia gani inaweza kusahihisha data ya majaribio?

Kuhusu masuala haya, tutayaelezea kwa undani katika sehemu za juu na za juu hapa chini.
2. Maarifa ya juu

Kuhusiana na kiasi cha muda halisi cha umeme wa PCR, ni lazima tutambue ukweli kwamba maelfu ya karatasi za utafiti wa kisayansi huchapishwa kila mwaka, kati ya ambayo teknolojia ya upimaji wa umeme ya PCR si idadi ndogo.

Ikiwa hakuna kiwango cha kawaida cha kupima majaribio ya kiasi cha umeme cha PCR, matokeo yanaweza kutofautiana sana.Kwa jeni lile lile la spishi sawa, kwa mbinu sawa ya uchakataji, matokeo ya ugunduzi pia yatatofautiana sana, na itakuwa vigumu kwa wanaochelewa kurudia matokeo sawa.Wewe Hakuna anayejua lipi lililo sahihi na lipi lisilo sahihi.

Je, hii ina maana kwamba kiasi cha umeme cha PCR ni teknolojia ya kudanganya au teknolojia isiyotegemewa?Hapana, ni kwa sababu PCR ya kiasi cha fluorescent ni nyeti zaidi na sahihi zaidi, na operesheni mbaya kidogo itatoa matokeo kinyume kabisa.Hasara ndogo ni maili elfu moja.Mwandishi wa makala anaweza kuteswa mara kwa mara na wakaguzi.Wakati huo huo, wakaguzi wa jarida pia ni ngumu kuchagua kutoka kwa matokeo tofauti ya majaribio.

Yote kwa yote, ikiashiria ukosefu wa maafikiano katika majaribio ya PCR ya wakati halisi.Ili kufikia mwisho huu, wanasayansi wakuu katika tasnia walianza kuunda viwango,kuwahitaji wachangiaji kutoa baadhi ya maelezo muhimu ya majaribio na usindikaji wa data (ikiwa ni pamoja na data muhimu) katika makala ili kufikia viwango hivi .

Wakaguzi wanaweza kuhukumu ubora wa jaribio kwa kusoma maelezo haya;wasomaji wa siku zijazo pia wanaweza kutumia hii kurudia jaribio au kuboresha jaribio.Kisha matokeo ya majaribio yaliyopatikana kwa njia hii yamejaa habari, ubora wa juu, na inaweza kutumika.

MIBBI (Maelezo ya Chini ya Uchunguzi wa Kibiolojia na Kibiolojia -http://www.mibbi.org) ilitokea.MIBBI ni mradi ambao hutoa viwango vya majaribio.Inachapishwa kwa asili.Mradi huu unalenga majaribio mbalimbali ya kibiolojia, ikiwa ni pamoja na baiolojia ya seli, Microarray, qPCR tutakayojadili sasa, n.k., na hutoa kwa kila aina ya majaribio wakati wa kuwasilisha miswada.Habari hiyo inapaswa kutolewa kila wakati.

Katika mradi wa MIBBI, kuna nakala mbili zinazohusiana na PCR ya kiasi cha umeme, ambayo ni.:
·RDML (Lugha ya Arufu ya Data ya PCR ya Wakati Halisi) - lugha iliyopangwa na mwongozo wa kuripoti kwa data ya muda halisi ya PCR;
·MIQE (Maelezo ya Chini ya Uchapishaji wa Majaribio ya PCR ya Muda Halisi) – maelezo ya chini kabisa ya uchapishaji wa makala kuhusu majaribio ya kiasi cha PCR ya muda halisi.
Kwanza, hebu tuzungumze juu ya RDML, uainishaji wa istilahi.

Ikiwa hakuna ufafanuzi wa kawaida kwa kila kitu, haiwezekani kuendelea na majadiliano, ndiyo sababu maelezo ya maneno ni muhimu sana katika mtihani.
Istilahi iliyotumika katika jaribio la kiasi cha umeme cha PCR inajumuisha maudhui yafuatayo.QIAGEN ametufanyia muhtasari bora zaidi.Yafuatayo yote ni kavubidhaa .

Mkondo wa kukuza
Mviringo wa ukuzaji hurejelea kipindo kilichofanywa wakati wa mchakato wa PCR, na nambari ya mzunguko kama abscissa na kiwango cha umeme cha wakati halisi wakati wa majibu kama kiratibu.

Curve bora ya ukuzaji inapaswa kuwa na sifa zifuatazo: msingi ni gorofa au umepungua kidogo, na hakuna mwelekeo wazi wa juu;hatua ya inflection ya curve ni wazi, na mteremko wa awamu ya kielelezo ni sawia na ufanisi wa ukuzaji.Kadiri mteremko unavyoongezeka, ndivyo ufanisi wa ukuzaji unavyoongezeka;curve ya jumla ya amplification Sambamba ni nzuri, ikionyesha kwamba ufanisi wa amplification wa kila tube ni sawa;awamu ya kielelezo cha curve ya ukuzaji wa sampuli za mkusanyiko wa chini ni dhahiri.

Msingi (Msingi)
Msingi ni kiwango cha kelele cha mzunguko wa mapema, kwa kawaida hupimwa kati ya mzunguko wa 3 na wa 15, kwa sababu ongezeko la thamani ya fluorescence linalosababishwa na bidhaa ya ukuzaji haliwezi kutambuliwa katika kipindi hiki.Idadi ya mizunguko inayotumika kukokotoa msingi inaweza kutofautishwa na inaweza kuhitaji kupunguzwa ikiwa viwango vya juu vya violezo vitatumika au ikiwa kiwango cha usemi cha jeni lengwa ni cha juu.

Kuweka msingi kunahitaji kutazama data ya fluorescence kutoka kwa mstari wa ukuzaji wa curve .Msingi umewekwa ili ukuaji wa curve ya ukuzaji uanze na nambari ya mzunguko kubwa kuliko nambari ya juu ya mzunguko wa msingi.Misingi inahitaji kuwekwa kibinafsi kwa kila mlolongo lengwa.Maadili ya wastani ya fluorescence yaliyogunduliwa katika mizunguko ya mapema yanahitajika kupunguzwa kutoka kwa maadili ya fluorescence yaliyopatikana katika bidhaa zilizoimarishwa.Matoleo ya hivi punde ya programu mbalimbali za PCR ya Wakati Halisi huruhusu uboreshaji kiotomatiki wa mipangilio ya msingi kwa sampuli mahususi.

Wakati wa mizunguko michache ya kwanza ya mmenyuko wa ukuzaji wa PCR, ishara ya fluorescence haibadilika sana.Kukaribia mstari wa moja kwa moja kunaitwa msingi, lakini tukiangalia kwa makini mizunguko michache ya kwanza, tunaona kwamba ndani ya msingi ni nini kinatokea kwenye picha hapa chini.

Usuli unarejelea
thamani isiyo maalum ya fluorescence katika mmenyuko .Kwa mfano: kuzima kwa fluorescence isiyofaa;au idadi kubwa ya violezo vya DNA vyenye nyuzi mbili kutokana na matumizi ya SYBR Green.Vipengee vya usuli vya mawimbi huondolewa kihisabati na kanuni ya programu ya PCR ya Wakati Halisi.

Ishara ya mwandishi
Mawimbi ya ripota hurejelea mawimbi ya umeme yanayotolewa na SYBR Green au vichunguzi mahususi vya mfuatano vilivyo na alama za umeme wakati wa PCR ya Wakati Halisi.

Mawimbi ya Kawaida ya Ripota (RN)
RN inarejelea ukubwa wa umeme wa rangi ya ripota ikigawanywa na ukubwa wa umeme wa rangi ya rejeleo tulivu inayopimwa katika kila mzunguko.

Passive Reference Dye
Katika baadhi ya PCR za Wakati Halisi,rangi ya umeme ROX inatumika kama marejeleo ya ndani ya kuhalalisha ishara ya umeme.Inasahihisha kwa tofauti kutokana na upigaji bomba usio sahihi, nafasi ya kisima, na kushuka kwa kiwango cha umeme kwa misingi ya kisima.

Kizingiti cha fluorescence (kizingiti)
ilirekebishwa juu ya thamani ya usuli na kwa kiasi kikubwa chini ya thamani ya tambarare ya curve ya ukuzaji.Ni lazima iwe katika eneo la mstari wa curve ya ukuzaji, ikiwakilisha safu ya mstari wa kumbukumbu ya utambuzi wa PCR.Vizingiti vinapaswa kuwekwa katika mwonekano wa curve ya ukuzaji wa logari ili awamu ya mstari-logi ya PCR iweze kutambulika kwa urahisi.Ikiwa kuna jeni nyingi zinazolengwa katika PCR ya Wakati Halisi, lazima iwekwe kiwango cha juu kwa kila lengo .Kwa ujumla, ishara ya umeme ya mizunguko 15 ya kwanza ya mmenyuko wa PCR hutumiwa kama ishara ya usuli ya umeme, na kizingiti cha umeme ni mara 10 ya kupotoka kwa kiwango cha ishara ya umeme ya mizunguko 3 hadi 15 ya kwanza ya PCR, na kizingiti cha fluorescence kinawekwa katika awamu ya amponplification ya PC.Kwa ujumla, kila chombo kina kizingiti chake cha fluorescence kilichowekwa kabla ya matumizi.

Kizingiti cha Mzunguko (CT) au Sehemu ya Kuvuka (CP)
Mzunguko ambao curve ya ukuzaji huvuka kizingiti (yaani, mahali ambapo utambuzi wa fluorescence huongezeka sana).CT inaweza kuwa sehemu na kiasi cha kuanzia kiolezo kinaweza kuhesabiwa.Thamani ya CT inawakilisha idadi ya mizunguko inayopatikana wakati mawimbi ya umeme katika kila bomba la majibu la PCR inafikia kizingiti kilichowekwa.Kuna uhusiano wa mstari kati ya thamani ya CT ya kila kiolezo na logariti ya nambari ya nakala ya mwanzo ya kiolezo,juu ya nambari ya nakala ya awali, thamani ya CT ni ndogo, na kinyume chake.Mviringo wa kawaida unaweza kufanywa kwa kutumia kiwango chenye nambari ya nakala ya awali inayojulikana, ambapo abscissa inawakilisha thamani ya CT, na kiratibu kinawakilisha logariti ya nambari ya nakala ya kwanza.Kwa hiyo, mradi tu thamani ya CT ya sampuli isiyojulikana inapatikana, nambari ya nakala ya awali ya sampuli inaweza kuhesabiwa kutoka kwa curve ya kawaida.

Thamani ya ΔCT
Thamani ya ΔCT inaelezeatofauti kati ya jeni lengwa na thamani ya CT ya jeni ya marejeleo mahususi, kama vile jeni la utunzaji wa nyumba, na hutumika kuhalalisha kiasi cha kiolezo kinachotumika:
⇒ΔCT = CT (jini inayolengwa) - CT (jeni la kumbukumbu asilia)

ΔΔCT Thamani
Thamani ya ΔΔCT inaeleza tofauti kati ya wastani wa thamani ya ΔΔCT ya sampuli ya mambo yanayokuvutia (kwa mfano, seli zilizochochewa) na wastani wa thamani ya ΔΔCT ya sampuli ya marejeleo (km, seli zisizochochewa).Sampuli ya marejeleo pia inaitwa sampuli ya urekebishaji na sampuli zingine zote zinarekebishwa kwa hii kwa hesabu ya jamaa:
⇒ΔΔCT = wastani ΔCT (sampuli ya riba) - wastani ΔCT (sampuli ya marejeleo)

Jeni za marejeleo asilia (jeni za marejeleo asilia)
Viwango vya kujieleza vya jeni asilia za marejeleo, kama vile jeni za utunzaji wa nyumba (jeni za utunzaji wa nyumba), hazitofautiani kati ya sampuli.Kulinganisha thamani za CT za jeni la marejeleo na jeni lengwa huruhusu kiwango cha kujieleza cha jeni lengwa kusawazishwa hadi kiasi cha ingizo RNA au cDNA (angalia sehemu ya thamani za ΔCT hapo juu).

Jeni za kumbukumbu za ndani ni sahihi kwauharibifu wa RNA unaowezekana au kuwepo kwa vizuizi vya kimeng'enya katika sampuli za RNA, pamoja na tofauti za maudhui ya RNA, ufanisi wa unukuzi wa kinyume, urejeshaji wa asidi ya nukleiki, na utunzaji wa sampuli.Ili kuchagua jeni mojawapo ya marejeleo, tulirekebisha algoriti ili kuruhusu uteuzi wake wa marejeleo mojawapo yanayotegemea mpangilio wa majaribio.

Udhibiti wa ndani
Mfuatano wa udhibiti ambao unakuzwa kwa mwitikio sawa na mfuatano lengwa na kuchunguzwa kwa uchunguzi tofauti (yaani, kutekeleza duplex PCR).Vidhibiti vya ndani mara nyingi hutumika kudhibiti upanuzi usiofanikiwa, kama vile wakati mfuatano lengwa haujatambuliwa.
Sampuli ya Urekebishaji
Sampuli ya marejeleo (kwa mfano, RNA iliyosafishwa kutoka kwa mstari wa seli au tishu) inayotumika katika ujanibishaji jamaa ili kulinganisha sampuli nyingine zote ili kubaini kiwango cha mwonekano wa jeni.Sampuli ya urekebishaji inaweza kuwa sampuli yoyote, lakini kwa kawaida ni udhibiti (kwa mfano, sampuli ambayo haijatibiwa au sampuli ya muda wa sufuri wa jaribio).

Vidhibiti vyema
tumia athari za udhibiti nakiasi kinachojulikana cha template.Vidhibiti chanya mara nyingi hutumika kuangalia kama seti ya kitangulizi au seti ya uchunguzi-kichunguzi inafanya kazi ipasavyo na kwamba maitikio yamewekwa ipasavyo.

Hakuna Kidhibiti cha Kiolezo (NTC)
Mwitikio wa udhibiti ambao una vipengele vyote muhimu vya mmenyuko wa ukuzaji isipokuwa kiolezo, ambacho kwa kawaida hubadilishwa na maji.Matumizi ya NTC yanaweza kupata uchafuzi unaosababishwa na uchafuzi wa kitendanishi au DNA ya kigeni, hivyo basi kuhakikisha uhalisi na kutegemewa kwa data ya utambuzi.Kukuza udhibiti wa NTC kunaonyesha uchafuzi.

Hakuna udhibiti wa RT (NRT)
Mchakato wa uchimbaji wa RNA unaweza kuwa na mabaki ya DNA ya jeni, ambayo ni hatari sana na ndiyo mhalifu anayeathiri ubora wa data na adui asilia wa qPCR, kwa hivyo wakati wa kubuni majaribio, ni lazima ubuniwe ili kukuza ugunduzi wa RNA pekee.Kuna njia mbili, moja ni kubuni primers kwenye introns, nyingine ni kuondoa kabisa DNA, ambayo ni bora zaidi, ambayo itajadiliwa baadaye.Udhibiti wa NTR ni kioo cha kichawi cha kugundua uchafuzi wa DNA.Ikiwa kuna amplification, inamaanisha kuna uchafuzi wa mazingira.

Viwango
Viwango ni sampuli za mkusanyiko unaojulikana au nambari ya kunakili ambayo hutumiwa kuunda mkunjo wa kawaida.Ili kuhakikisha uthabiti wa kiwango, kipande cha jeni kawaida huwekwa kwenye plasmid na kutumika kama kiwango.

Curve ya kawaida
kwa kawaida hupunguzwa ndani ya angalau gradient 5 za ukolezi na bidhaa ya kawaida kulingana na uwiano wa mara mbili, na pointi 5 hutolewa katika kuratibu za thamani ya CT na nambari ya nakala, na pointi zimeunganishwa ili kuunda mstari ili kuzalisha curve ya kawaida.Kwa kila curve ya kawaida, uhalali wake unahitaji kuangaliwa.Thamani ya mteremko iko kati ya -3.3 na -3.8, na kila mkusanyiko unafanywa kwa mara tatu.Pointi ambazo ni tofauti sana na vidokezo vingine zinapaswa kutupwa.Thamani ya CT ya sampuli inayojaribiwa huletwa kwenye curve ya kawaida, na kiwango cha kujieleza cha sampuli inayojaribiwa kinaweza kuhesabiwa.

Thamani ya CT ya sampuli inayojaribiwa huletwa kwenye curve ya kawaida, na nambari ya nakala ya awali ya sampuli inayojaribiwa inaweza kuhesabiwa.

Ufanisi na Mteremko
Mteremko wa curve ya kawaida inawakilisha ufanisi wa PCR ya wakati halisi.
·Mteremko wa -3.322 unaonyesha kuwa ufanisi wa ukuzaji wa PCR ni 1, au 100% ufanisi, na kiasi cha bidhaa ya PCR huongezeka maradufu katika kila mzunguko.
· Mteremko chini ya -3.322 (kwa mfano, -3.8) unaonyesha ufanisi wa PCR
·Mteremko mkubwa kuliko -3.322 (kwa mfano, -3.0) unaonyesha kuwa ufanisi wa PCR unaonekana kuwa mkubwa zaidi ya 100%, jambo ambalo linashangaza, je, mzunguko mmoja wa PCR unawezaje kuzalisha zaidi ya mara mbili ya bidhaa iliyokuzwa?Hali hii hutokea katika awamu isiyo ya mstari ya mmenyuko wa PCR, yaani, kuna kiasi kikubwa cha amplification isiyo maalum.

kuyeyuka curve
Baada ya ukuzaji wa qPCR kukamilika, bidhaa ya PCR huwashwa.Joto linapoongezeka, bidhaa ya ukuzaji wa nyuzi-mbili huyeyuka hatua kwa hatua, na kusababisha kupungua kwa nguvu ya fluorescence.Wakati joto fulani (Tm) linafikiwa, idadi kubwa ya bidhaa itayeyuka.Fluorescence hupungua kwa kasi.Bidhaa tofauti za PCR zina thamani tofauti za Tm na viwango tofauti vya joto vya kuyeyuka, ili umaalumu wa PCR uweze kutambuliwa.

Mviringo unaoyeyuka (curve derivative)
Mviringo wa kuyeyuka hutokana na kuunda ramani ya kilele, ambayo inaweza kuonyesha kwa njia angavu zaidi hali ya vipande vya bidhaa za PCR.Kwa kuwa halijoto inayoyeyuka ni thamani ya Tm ya kipande cha DNA, baadhi ya vigezo vinavyoathiri thamani ya Tm ya kipande cha DNA vinaweza kutathminiwa, kama vile ukubwa wa kipande, maudhui ya GC, n.k. Kwa ujumla, kulingana na kanuni zetu za muundo wa msingi,urefu wa bidhaa iliyoimarishwa ni kati ya 80-300bp, kwa hivyo halijoto ya kuyeyuka inapaswa kuwa kati ya 80°C na 90°C.

Ufafanuzi wa curve ya kuyeyuka: Ikiwa kilele kikuu pekee kinaonekana kati ya 80 ° C-90 ° C, inamaanisha kuwa PCR ya upimaji wa fluorescent ni kamilifu;ikiwa kilele kikuu kinaonekana kati ya 80 ° C-90 ° C na vilele vingine vinaonekana chini ya 80 ° C, dimer ya kwanza inazingatiwa kimsingi.Unaweza kujaribu kuongeza joto la annealing ili kutatua;ikiwa kilele kikuu kinaonekana kati ya 80 ° C-90 ° C, na kilele cha mchanganyiko kinaonekana tena wakati joto linapoongezeka, kimsingi inachukuliwa kuwa kuna uchafuzi wa DNA, na DNA inahitaji kuondolewa katika hatua ya awali ya jaribio.

Bila shaka, bado kuna baadhi ya hali zisizo za kawaida, ambazo zitavunjwa moja kwa moja hapa chini.
3. Maarifa ya juu

Ili kufanya qPCR, lazima niseme MIQE,Taarifa ya Chinikwa Uchapishaji waKiasiPCR ya Wakati HalisiMajaribio—maelezo ya chini zaidi ya kuchapisha makala kuhusu PCR halisi ya mudamajaribio.Ili kurahisisha uelewa wa kila mtu, tutarahisisha maudhui muhimu.

Unaweza kutafuta maandishi asilia ya MIQE kwenye mtandao, na jambo la muhimu zaidi ni kwamba inabainishaorodha ya data inayohitaji kutolewa wakati wa kuchapisha makala .

Wakaguzi wanaweza kuhukumu ubora wa jaribio kwa kusoma maelezo haya;wasomaji wa siku zijazo wanaweza pia kutumia hii kurudia au kuboresha jaribio.
Ni vyema kutambua kwamba katika orodha hii, umuhimu wa kila orodha umewekwa na E au D kwa mtiririko huo.Ina maana gani?E: taarifa muhimu (lazima iwasilishwe);D: taarifa zinazohitajika (toa iwezekanavyo).

MIQE (1)—Muundo wa Majaribio
Wahuni wengi ambao wamekamilisha utetezi wao baada ya kumaliza masomo yao ya kuhitimu hawatajua jinsi ya kuunda jaribio kwa kujitegemea, kufungua daftari zao, na kufanya kile ambacho mwalimu anawaambia wafanye.Kama matokeo, muundo wa majaribio haukuwa mkali, na idara ya wahariri wa gazeti hilo ilisema kwamba walitaka kuunda picha hii na picha hiyo, kwa hivyo walifanya kwa kushangaa.Hivi ndivyo majungu yanatengenezwa!

Karibu na nyumbani, kanuni ya kwanza ya jaribio ni kuamuaukali wa mantiki ya majaribio.Jambo la msingi zaidi ni muundo wa majaribio, na jambo muhimu zaidi kuhusu muundo wa majaribio ni jinsi ya kuweka sampuli lengwa, sampuli ya marejeleo (udhibiti), na idadi ya marudio, ili data ya majaribio iweze kurejelewa, kulinganishwa, na kusadikisha.

Sampuli ya lengoinarejelea sampuli inayotuhitaji kutambua jeni lengwa baada ya matibabu fulani.Sampuli ya kumbukumbuni sampuli bila matibabu yoyote, ambayo mara nyingi hujulikana kama aina ya mwitu katika biolojia.

Nakala za majaribioni muhimu sana.Kwa ujumla, idadi ya nakala za ushawishi lazima iwe zaidi ya tatu.Ni muhimu kutofautisha ni nini urudufishaji wa kibayolojia na urudiaji wa kiufundi ni nini.

Nakala za Kibiolojia: Jaribio sawa la uthibitishaji lililofanywa kwa nyenzo tofauti (wakati, mimea, batches, sahani za majibu).

Rudufu ya kibiolojia
Hebu tuchukue matibabu ya dawa ya pilipili kama mfano.Tunataka kunyunyizia dawa kwenye mimea mitatu ya ABC, kisha mimea mitatu ya ABC ni nakala tatu za kibayolojia, na ni jaribio lile lile la uthibitishaji lililofanywa kwa nyenzo tofauti.Lakini kama jaribio, udhibiti unahitajika, kwa hivyo tunaweza kunyunyizia moja ya matawi ya mmea A kuunda kikundi cha majaribio cha mmea A, na sio kunyunyizia matawi mengine ya mmea A kuunda kikundi cha kudhibiti.Fanya vivyo hivyo kwa B na C.

Nakala za Kiufundi (Nakala za Kiufundi): Ni jaribio la mara kwa mara lililoundwa ili kuepuka makosa yanayosababishwa na uendeshaji, ambayo kwa kweli ni shimo la nakala iliyojumuishwa kwenye nyenzo sawa.Matibabu na vidhibiti lazima viwe na mipangilio inayojirudia (angalau tatu) ya jeni lengwa na jeni la marejeleo la ndani.

Marudio ya kiufundi
Chukua pilipili iliyotiwa dawa kama mfano tena.Kwa kikundi cha majaribio cha mmea A, tulitengeneza mashimo matatu ya PCR ya 1, 2, na 3 kwa jeni inayolengwa na jeni la marejeleo ya ndani mtawalia, ili kuchukua wastani baada ya kugunduliwa.Kwa udhibiti wa mmea A Vikundi pia vinatibiwa kwa njia sawa.Vile vile, fanya matibabu sawa kwa mimea B na C.Hii ni marudio ya kiufundi.

Inafaa kuzingatia hilokinachoingia kwenye takwimu ni marudio ya kibayolojia, na marudio ya kiufundi ni kupima kama kuna matukio yoyote ya nasibu katika mchakato wa majaribio, ili kufanya matokeo ya majaribio yawe ya kuaminika, yaani, kuepuka makosa kwa kuchukua wastani wao kama tunavyosema mara nyingi.

Vidhibiti Hasi—NTC na NRT
NTC (Udhibiti wa Hakuna Kiolezo), kidhibiti kisicho na kiolezo, kinatumika kuthibitisha kama nyenzo ya majaribio imechafuliwa.Kwa ujumla, maji hutumiwa kama kiolezo.Ikiwa kuna mmenyuko wa fluorescent, inaonyesha kuwa uchafuzi wa asidi ya nucleic umetokea katika maabara.

Uchafuzi huu hutoka kwa: maji machafu, vitendanishi visivyo na sifa vyenye DNA endogenous, uchafuzi wa primer, uchafuzi wa vifaa vya maabara, uchafuzi wa erosoli, nk, haja ya kutumia scavengers ya RNase na inhibitors ya RNase.Uchafuzi wa erosoli ndio ngumu zaidi kupata.Hebu wazia maabara yako ni kama moshi, na asidi mbalimbali za nukleiki zikiwa zimening'inia hewani.

NRT (No-Reverse Transcriptase), kidhibiti kisicho na unukuzi wa kinyume, ni RNA isiyo kinyume iliyonakiliwa kama udhibiti hasi, ambao ni udhibiti wa mabaki ya gDNA.

Wakati wa kufanya usemi wa jeni, kiasi cha RNA hugunduliwa kwa kugundua kiasi cha cDNA baada ya unukuzi wa kinyume.Ikiwa kuna mabaki ya gDNA wakati RNA inapotakaswa, itasababisha makosa katika matokeo ya majaribio, kwa sababu matokeo halisi yaliyopatikana ni gDNA na cDNA.Katika kiwango cha jumla, sio cDNA tu, gDNA inahitaji kuondolewa kabisa wakati wa uchimbaji wa RNA.

MIQE (2)—mfano wa habari
Kinachojulikana kama maelezo ya sampuli inamaanisha kuwa tunapochapisha makala kuhusu qPCR, ni lazima tueleze maelezo ya sampuli kwa uwazi, ambayo ni sehemu ya lazima ya makala.Vile vile, tunapochakata sampuli, lazima pia tudhibiti utendakazi wetu ili kuhakikisha uhalali wa sampuli.

Maelezo ya sampuli ni matokeo tu, na tunapaswa kuzingatia zaidi nyenzo zilizochukuliwa wakati wa jaribio zima.

Uchaguzi wa nyenzo za majaribio
Sampuli za damu - chagua damu safi, si zaidi ya masaa 4.Sampuli za seli - chagua kukusanya seli mpya katika kipindi cha ukuaji wa nguvu.Tishu za Wanyama—Chagua tishu mpya zinazokua kwa nguvu.Tishu za mmea - Chagua tishu safi, changa.

Lazima umegundua kuwa kuna neno muhimu katika sentensi hizi chache: fresh .
Kwa sampuli zilizo hapo juu, vifaa bora zaidi, vya gharama nafuu na dhabiti kwenye soko ni vifaa vya Foregene, ambavyo vinaweza kutoa DNA na RNA zao kwa haraka na kwa urahisi.

Seti ndogo ya DNA ya Damu

Seli Jumla ya Seli ya Kutenga ya RNA

Seti ya Kutenga ya RNA ya Wanyama

Seti ya Kutenga ya Jumla ya RNA ya mmea

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Seti ya Kutenga ya DNA ya mmea

Uhifadhi wa nyenzo za majaribio
Kwa ujumla, hatupendekezi kuhifadhi sampuli, ikiwa hali inaruhusu.Hata hivyo, kuna marafiki wengi ambao hawawezi kufanya majaribio mara tu baada ya kuchukua sampuli, na wengine hata wanahitaji kubeba matenki ya nitrojeni kioevu hadi shambani kwa sampuli.

Kwa aina hii ya rafiki anayefanya kazi kwa bidii, naweza kusema tu kwamba huelewi matumizi ya reagent.Sasa makampuni mengi ya matumizi ya reagent huzalisha vitendanishi vinavyoweza kuhifadhi sampuli za RNA kwenye joto la kawaida, na unaweza kuchagua kuzitumia.Njia ya kawaida ya kuhifadhi ni uhifadhi wa nitrojeni kioevu, kwa kutumia tank ndogo ya kioevu ya nitrojeni ambayo ni rahisi kubeba.Baada ya kurudisha sampuli kwenye maabara, ihifadhi kwenye jokofu -80 ° C.

Kwa majaribio yanayohusisha RNA, kanuni ya maneno sita lazima ifuatwe:joto la chini, hakuna enzymes;naharaka .

Dhana ya joto la chini ni rahisi kuelewa;bila enzymes, RNase iko kila mahali katika ulimwengu tunamoishi (vinginevyo ungeuawa na VVU), hivyo jinsi ya kuepuka RNase wakati wa kufanya majaribio ni dhana muhimu sana;haraka,Hakuna Kung Fu duniani ambayo haiwezi kuvunjika, kasi tu haiwezi kukatika.

Kwa hiyo, kwa maana, muda mfupi wa uchimbaji, kit bora zaidi.MbonaForegene's kit kusisitiza kasi, kwa sababu wanaijua vizuri.

PS: Wasichana wengine hufanya majaribio kwa uangalifu sana, lakini si nzuri kama slam dunk baada ya miaka kadhaa ya kazi.Wanahisi kwamba Mungu hana haki, analalamika juu ya wengine, na anatafuta uzima.Kwa kweli, hakuelewa.Hakulinda RNA vizuri, na mchezaji wa slam dunk alikuwa mahiri.Alipokuwa akifanya majaribio, alifikiri kwamba angemaliza slam dunk kwa mara tatu, mara tano na mgawanyiko mbili, lakini alifanya majaribio vizuri.

Kumbuka: Polepole, uwezekano zaidi wa uvamizi wa RNase.Jinsi ya kujifundisha kuwa haraka?Hakuna njia, fanya mazoezi zaidi.

Kwa majaribio tofauti na sampuli tofauti, bado ni muhimu kusoma fasihi zaidi na kuchagua mbinu inayofaa kwa usindikaji.Kwa mchakato wa ukusanyaji na uhifadhi wa sampuli, MIQE inahitaji kwamba lazima iandikwe waziwazi kwenye karatasi, ili wakaguzi waweze kukagua kutegemewa kwa karatasi, na pia ni rahisi kwa vijana waliopigwa na bumbuwazi kurudia jaribio lako.

Ingawa majaribio ya kibaolojia ni magumu, ni ya hali ya juu.Usipokuwa mwangalifu, unaweza kupindua ulimwengu.Kwa mfano, kufanya SARS kuwa shida ya kemikali, au kutengeneza mchele wa mseto kuokoa watu bilioni 1.3.Picha hapa chini ni jaribio la kemikali, unapaswa kuelewa jinsi unavyojivunia utafiti wako kwa kuangalia tu mwonekano wake unaofanana na Dick.Kusahau, si nyeusi naye.

MIQE (3) - uchimbaji wa asidi ya nucleic.
Uchimbaji wa asidi ya nyuklia ni tukio kubwa, na majaribio yote ya baiolojia ya molekuli huanza na uchimbaji wa asidi ya nukleiki.Kwanza kabisa, hebu tunakili maudhui ya MIQE kwenye uchimbaji wa asidi ya nukleiki.

Kuangalia fomu hii, huwezi kukaa juu ya uso.Fomu ni fundisho.Ili kuwa mwanafunzi bora, lazima uulize kwa nini.Maudhui muhimu ya jedwali hili ni: Fuatiliausafi, uadilifu, uthabiti, na kiasi cha uchimbaji wa RNA .

Sehemu ya kwanza yamchakato au chombo ni hatua ya uchimbaji wa asidi nucleic.Ikiwa unatumia kichimbaji cha asidi ya nuklei kiotomatiki kutoa (ya hali ya juu, tafadhali wasiliana nami kwa ununuzi), unahitaji kuonyesha jina la mfano la chombo.

Jina la kit na

ni kit gani kilitumika kwa maelezo ya mabadiliko, ni vitendanishi gani maalum vilivyoongezwa au ni shughuli gani maalum zilizofanywa zinapaswa kuelezwa kwa uwazi ili wengine waweze kurudia jaribio lako kwa urahisi.

Watu wengine huongeza vitendanishi maalum wakati wa kutoa sampuli maalum, wakidhani kuwa hii ni silaha yao ya siri na usiwaambie wengine.Huku wakiiweka siri, pia hupoteza fursa ya kufanya makala yako ing'ae.Usiwe wajanja, lazima uwe mwaminifu zaidi kuliko Zhang wa nchi katika utafiti wa kisayansi, ukitaka kuwa wajanja, makala itakufanya mjinga.

lazima ukumbuke nambari ya bidhaa ya kitunapoagiza kit na kuandika makala.Kwa jumla kuna nambari mbili kwenye kifurushi: Nambari ya paka—katalogi (nambari ya bidhaa, nambari ya makala), Loti—nambari ya kura ya bidhaa ( Inatumika kuonyesha kundi ambalo bidhaa ilitoka).

Kwa kuongeza, nambari ya CAS hutumiwa mara nyingi wakati wa kuagiza vitendanishi vya biochemical, na nitaitangaza pamoja.Nambari ya CAS ni nambari iliyotolewa na Jumuiya ya Kemikali ya Marekani kwa kila dawa mpya ya kemikali.Kwa ujumla, nambari tatu zimeunganishwa kwa dashi.Nambari ya CAS ya Rushui: 7732-18-5.Kemikali mara nyingi huwa na lakabu nyingi, lakini nambari ya CAS ni ya kipekee.Wakati wa kuagiza dawa, unaweza kuangalia nambari yake ya CAS kwanza.

Karibu na nyumbani, kwa nini tunapaswa kuelezea mambo haya kwa uwazi?Kwa kweli, pia ni kuangalia ubora wa uchimbaji wa RNA.Matumizi ya vyombo na vifaa vitafanya uchimbaji wa RNA kuwa thabiti zaidi.Kiwango cha uchimbaji wa maabara ya kawaida sio kubwa, na inaweza kupatikana kwa kits.

Maelezo ya matibabu ya DNase au RNase
Suala muhimu la PCR ya kiasi cha fluorescent ni kuzuia uchafuzi wa DNA, na usijaribu ikiwa kuna uchafuzi.Kwa hivyo, ni muhimu kutaja mchakato uliotumia kuchakata DNA, ili kuonyesha kwamba DNA katika mchakato wa majaribio imeondolewa kabisa na kabisa.inawakilishwa na mchoro wa mpangilio.

Mchoro wa kimkakati wa RNA na DNA
Kwa ujumla, njia ya kuondoa DNA ni kutibu RNA na DNase baada ya uchimbaji.Walakini, hizi ni njia za zamani.Vifaa vya uchimbaji vya RNA vya kibiashara vimeweza kuondoa DNA wakati wa mchakato wa uchimbaji bila kuongeza DNase .Kwa mfano, mfululizo wa kits kutoka Foregene.

Kumbuka: Kuondoa DNA wakati wa uchimbaji wa RNA ni upanga hatari sana wenye ncha mbili, ambayo itaongeza muda wa operesheni ya uchimbaji wa RNA na kuongeza hatari ya uharibifu wa RNA.Kimsingi, ni biashara kati ya mavuno ya RNA na usafi.

Kwa kuongeza, kiasi cha DNase kilichoongezwa kwenye safu ya utangazaji ya silika ni ndogo sana, na DNase ya ubora wa juu lazima itumike ili kufikia athari.DNase ambayo haijaboreshwa haiwezi kuyeyushwa haraka na kikamilifu.Hili ni jaribio la kiwango cha kiufundi cha mfanyabiashara.Bila shaka, kuna wafanyabiashara wa ajabu zaidi ambao wanajivunia kwamba DNA inaweza kuondolewa bila DNase.Inaweza kusemwa kwamba mtu yeyote anayejisifu kuwa DNA inaweza kuondolewa kabisa bila DNase ni mhuni.DNA ni muundo thabiti wa nyuzi-mbili, na haiwezi kufutwa kwa kuzungumza na kucheka tu.

Tathmini ya uchafuzi
njia ya tathmini: kugundua electrophoresis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, upakiaji 1-3 ul

Uchambuzi wa kiasi cha asidi ya nucleic
kawaida hupimwa kwa kutumia spectrophotometer ya UV.Acha kwanza nitangaze maana ya maadili matatu ya OD260, OD280, na OD230.
·OD260nm: Ni urefu wa mawimbi wa ufyonzaji wa kilele cha juu zaidi cha ufyonzwaji wa asidi nukleiki, na thamani iliyopimwa vyema zaidi ni kati ya 0.1 hadi 1.0.Ikiwa sivyo, punguza au uzingatie sampuli ili kuileta ndani ya masafa.
·OD280nm: Ni urefu wa wimbi la ufyonzaji wa kilele cha juu zaidi cha ufyonzaji wa protini na dutu fenoli.
·OD230nm: Ni urefu wa wimbi la ufyonzaji wa kilele cha juu zaidi cha wanga.

Ifuatayo, hebu tuzungumze juu ya jukumu la kila kiashiria.Kwa A260, inaweza kutumika kupima mavuno ya asidi ya nucleic.Wakati OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Kwa usafi, tunahitaji kuangalia uwiano ambao tunaona kwa kawaida: OD260/280 na OD260/230.
·DNA Safi: OD260/280 ni takriban sawa na 1.8.Inapokuwa kubwa kuliko 1.9, inaonyesha kuwa kuna uchafuzi wa RNA, na ikiwa chini ya 1.6, inaonyesha kuwa kuna uchafuzi wa protini na phenoli.
·RNA Safi: 1.7
·OD260/230: Iwe ni DNA au RNA, thamani ya marejeleo ni 2.5.Wakati ni chini ya 2.0, inaonyesha kuwa kuna uchafuzi wa sukari, chumvi na suala la kikaboni.

uadilifu wa RNA

Ni muhimu sana kupima uadilifu wa RNA.Kwa ujumla, ni muhimu kufanya jaribio la jeli ya chembechembe za RNA ili kuangalia kama mwangaza kati ya 28S na 18S RNA ni uhusiano wa pande mbili.Wakati bendi ya tatu ya 5S inaonekana, ina maana kwamba RNA imeanza kupungua, isipokuwa kwa invertebrates.

Data ya tathmini ya ubora wa RNA: Kando na majaribio yaliyo hapo juu, pia kuna majaribio ya hali ya juu zaidi ya chombo kulingana na uadilifu wa RNA, kama vile mtihani wa uadilifu wa RQI wa mfumo wa Experion otomatiki wa electrophoresis, ambao unaweza kutambua ikiwa RNA imeharibika bila kuonekana.

Katika utafiti wa kisayansi, PCR ya kiasi cha fluorescent ni ulinganisho kati ya jeni lengwa na jeni la marejeleo ya ndani.Kwa hiyo, katika mchakato wa uhifadhi wa sampuli ya RNA, uchimbaji wa RNA, nk, lengo la msingi ni kuhakikisha uadilifu wa RNA.

Jinsi uadilifu wa RNA huathiri usawa kati ya jeni lengwa na jeni la marejeleo la ndani inaweza kueleweka kwa urahisi kutoka kwa takwimu iliyo hapa chini.Uharibifu utasababisha kutokamilika kwa jeni, iwe ni kutokamilika kwa jeni la kumbukumbu la ndani au kutokamilika kwa jeni lengwa, kutakuwa na athari kubwa kwenye data.

Mchoro wa mpangilio wa jeni lengwa na jeni la marejeleo, lazima lisiwe kweli

Jaribio la kuzuia (ikiwa thamani ya CT imekandamizwa chini ya mkusanyiko wa juu au wa chini au hali nyingine)

Kwa kuchukua takwimu hii kama mfano, maadili ya Ct ya curve tano ni kama ifuatavyo.Usambazaji wa maadili ya CT kati ya curves haufanani, na maadili ya Ct yanachelewa chini ya viwango vya juu na vya chini, ambayo ni kesi ya kizuizi cha PCR.

Jambo kuu: Katika mchakato wa uchimbaji wa RNA, tunahitaji kuachana na maoni potofu na kuanzisha sahihi.

Wazo lisilo sahihi ni: Uchimbaji wa RNA hufuata tu mavuno, ukifikiri kwamba kiasi kikubwa cha RNA kilichopatikana, ni bora zaidi.Kwa kweli, tunapofanya quantification, ikiwa idadi ya jeni si kubwa sana, hatuhitaji RNA nyingi.Kiasi cha RNA unachotoa ni zaidi ya kutosha.

Dhana sahihi ni:Uchimbaji wa RNA unapaswa kufuata usafi, uadilifu na uthabiti.Usafi unaweza kuhakikisha kuwa unukuzi unaofuata wa kinyume haujazuiwa na data haitaathiriwa na DNA.Uadilifu huhakikisha usawa wa mifuatano lengwa na marejeleo ya ndani.Uthabiti huhakikisha upakiaji thabiti wa sampuli.

MIQE (4) - unukuzi wa kinyume
Dhana potofu: harakati za kuongeza kiasi cha sampuli.
Dhana sahihi: Fuatilia uthabiti (uthabiti), bila kujali kiasi cha RNA kilichopakiwa, ufanisi wa unukuzi wa kinyume unasalia kuwa thabiti, kuhakikisha kwamba tofauti katika cDNA zinaweza kuonyesha tofauti katika mRNA.
Tunaelezea mchakato huu na mchoro wa kimkakati:

Mchoro wa mpangilio wa ufanisi wa unukuzi wa kinyume, usiwe kweli
Kwanza kabisa, tunahitaji kuelewa tofauti kati ya mchakato wa unukuzi wa kinyume na mchakato wa PCR.PCR hupitia michakato mingi ya joto na annealing, na kipande cha lengo kinakua kwa kasi;wakati unukuzi wa kinyume hauna mchakato huu, tunaweza kufikiria kwamba unukuzi wa kinyume ni wa moja kwa moja Wakati wa mchakato wa kunakili, kama vipande vingi vya RNA.

kwani kuna wanaweza kupata vipande vingi vya Habari ya cDNA, inapaswa kueleweka kwa sasa, kwa sababu vipande vikubwa na vidogo vimenakiliwa kinyume, na haiwezekani kuzingatia kipande kimoja.Na kwa sababu kiasi cha RNA ni kidogo, kiasi cha cDNA kilichopatikana pia ni kidogo, tofauti na PCR, ambayo ina athari ya kukuza, hivyo kimsingi haiwezekani kugundua.

matokeo ya cDNA electrophoresis
Pili, hakika, unukuzi wa kinyume unafanywa moja kwa moja, lakini hakuna nakala ya kinyume kutoka kwa kampuni yoyote inayoweza kufikia athari hii.Kimsingi, ufanisi wa nakala nyingi za reverse huzunguka kati ya 30-50%.Ikiwa hali ndio hii, tungependelea kuwa na ufanisi wa unukuzi wa kinyume ulio thabiti, ambao ndio tunataka kuona kwenye takwimu: RNA 3 hupata cDNA 2, RNA 6 hupata cDNA 4, kwa hivyo haijalishi ni sampuli ngapi imepakiwa , ufanisi wa unukuzi wa kinyume ni thabiti.Hatutaki kuona hali ambapo ufanisi wa unukuzi wa kinyume si dhabiti na mkusanyiko wa juu umezuiwa.

Kwa hivyo, jinsi ya kuthibitisha ikiwa ufanisi wa unukuzi wa kinyume ni thabiti?Njia hiyo ni rahisi sana, unahitaji tu kufanya mtihani wa kulinganisha: moja ni kubadili maandishi katika cDNA baada ya dilution ya RNA mara mbili, na nyingine ni kufanya dilution mara mbili baada ya kuandika upya kwenye cDNA, na kisha kufanya qPCR kuona mteremko uliopatikana Je, ni thabiti.Kama mwanafunzi bora, unapaswa kuielewa kwa sekunde.Kama inavyoonyeshwa hapa chini:

Upunguzaji wa RNA na cDNA ili kupima kama ufanisi wa unukuzi wa kinyume ni thabiti
Reverse transcriptase na kit
PCR ya upimaji wa umeme kamili inawezaje kuwa na nakala bora ya reverse na vifaa.Reverse transcriptase imegawanywa katika aina mbili kulingana na chanzo, AMV auM-MLV, na utendaji wao ni sawa na ule ulioonyeshwa kwenye jedwali.

Shughuli ya RNase H
RNase H ni Ribonuclease H, jina la Kichina ni ribonuclease H, ambayo ni endoribonuclease ambayo inaweza haswa hidrolisisi ya RNA katika mnyororo wa mseto wa DNA-RNA.RNase H haiwezi kusaga viunga vya phosphodiester katika DNA au RNA yenye nyuzi moja au yenye nyuzi mbili, yaani, haiwezi kusaga DNA au RNA yenye nyuzi moja au yenye nyuzi mbili.Kawaida kutumika katika usanisi wa strand ya pili ya cDNA.

Ni jambo la ajabu.Tunasema kwamba reverse transcriptase ina shughuli ya RNase H, si kwamba reverse transcriptase ina RNase H, na huenda isiwezekane kutenganisha RNase H na reverse transcriptase, labda kwa sababu ya muundo wa vikundi fulani katika reverse transcriptase Shughuli hii inasababishwa na reverse transcriptase.

Kwa hivyo, bila kujali ufanisi wa juu wa uandishi wa kinyume wa AMV, shughuli yake ya RNase H hupunguza mavuno ya cDNA.Bila shaka, watengenezaji wa vitendanishi wanaboresha bidhaa zao mara kwa mara ili kuondoa shughuli ya RNase H katika nakala ya kinyume iwezekanavyo ili kuongeza mavuno ya cDNA.
Joto la kuchuja

Muundo wa sekondari wa RNA kwa joto tofauti
Tazama takwimu iliyo hapo juu kwa muundo wa pili wa RNA kwa viwango tofauti vya joto, na utumie zana ya mtandaoni ya mFold ili kubaini muundo wa pili wa kipande kinacholengwa chini ya hali maalum ya joto na mkusanyiko wa chumvi.Kwa 55 ° C, muundo wa pili wa RNA bado ni ngumu sana, reverse transcriptase haiwezi kufanya kazi, na muundo wa sekondari hauwezi kutatuliwa kabisa hadi 65 ° C, wakati joto la juu la AMV na M-MLV ni chini sana kuliko joto hili.
nini cha kufanya?Muundo wa pili ni upatanishi wa ziada wa kiolezo chenyewe, ambacho husababisha ushindani mkubwa kati ya nakala ya kwanza na ya kugeuza kinyume na kiolezo, na kusababisha msururu wa matatizo kama vile E ya chini na kutoweza kurudiwa vyema.

nini cha kufanya?Ongeza halijoto ya kuchubua tu kadiri uwezavyo.

Watengenezaji wengi wa vitendanishi wanaboresha nakala zao za reverse kupitia uhandisi jeni.Baadhi huongeza halijoto ya mmenyuko, kama vile Jifan na Aidelai, na baadhi huondoa kikundi hai cha kimeng'enya cha RNase H ili kuboresha uhusiano kati ya kimeng'enya na kiolezo cha RNA.Uhusiano wa juu unaweza kubana muundo wa pili kwa ushindani na kusoma vizuri, na pia kuboresha sana ufanisi wa unukuzi wa kinyume.
Jambo kuu: Unukuzi wa kinyume ni muhimu zaidi ili kufuatilia uthabiti wa ufanisi wa unukuzi wa kinyume (vimeng'enya lazima ziwe bora tu bali pia dhabiti), badala ya kiasi cha sampuli iliyopakiwa, ikiwa si PCR ya kiasi kikubwa cha fluorescent, haitawezekana hata kidogo.cDNA nyingi.
Watengenezaji anuwai pia wamefanya juhudi kadhaa katika kutafuta uthabiti.Kwa mfano, makampuni mengi sasa yamefunga unukuzi wa kinyume kama vifaa vya kawaida vya kuuza, ambalo ni chaguo zuri.
Kwa mfano, vifaa vya Foregene's RT Easy Series:

RT Easy I (Mchanganyiko mkuu wa seti ya usanisi ya safu ya kwanza ya cDNA)

MIQE (5) - habari ya jeni inayolengwa

Kielelezo hapo juu kinaelezea
1. Ikiwa jeni hili linafaa kwa majaribio yanayorudiwa kwa ujumla inaweza kuthibitishwa na majaribio yanayorudiwa.
2. Kitambulisho cha jeni, unajua.
3. Urefu wa jeni, urefu wa jumla wa jeni lengwa hakika hakuna tatizo.Wakati wa kuunda vianzio, hakikisha kwamba urefu wa amplicon ni kati ya 80-200bp ili kuhakikisha ufanisi bora wa ukuzaji.
4. Panga maelezo ya ulinganisho wa Mlipuko, jeni lengwa linahitaji kulinganishwa katika benki ya jeni ili kuzuia ukuzaji usio mahususi.
5. Uwepo wa pseudogenes.Pseudogene ni mlolongo wa DNA sawa na jeni la kawaida lakini hupoteza utendaji wake wa kawaida.Mara nyingi iko katika familia ya jeni nyingi ya eukaryotes.Kawaida inawakilishwa na ψ.Ni nakala ya DNA ya jenomu isiyofanya kazi katika jenomu ambayo inafanana sana na mfuatano wa jeni wa kusimba., kwa ujumla hazijanukuliwa, na hazina maana dhahiri ya kisaikolojia.
6. Nafasi ya primers jamaa na exons na introns.Katika miaka ya awali, tuliposuluhisha tatizo la uchafuzi wa DNA, mara nyingi tulizingatia nafasi za vianzio, exons na introni, na kwa ujumla tulizingatia kubuni viasili kwenye introni ili kuepuka ukuzaji wa DNA.Tafadhali angalia takwimu hapa chini: nyeusi inawakilisha introns, bluu mbalimbali kuwakilisha exons, pink inawakilisha primers kawaida, na nyekundu mkali inawakilisha intron-spanning primers.

Mpangilio, kamwe sio kweli
Je, hii inaonekana kama mpango mkamilifu, lakini kwa kweli, katika hali nyingi, primers za trans-intron sio za kichawi kama inavyofikiriwa, na pia zitasababisha ukuzaji usio maalum.Kwa hivyo njia bora ya kuzuia uchafuzi wa DNA ni kuondoa DNA kabisa.
7. Utabiri wa Muundo.Kwa kutumia mfano huu tena, tumia zana ya mtandaoni ya mFold ili kubainisha muundo wa pili wa kipande kinacholengwa katika viwango maalum vya joto na chumvi.

Muundo wa sekondari wa RNA kwa joto tofauti
Muundo wa pili ni upatanishi wa ziada wa kiolezo chenyewe, ambacho kitasababisha ushindani mkubwa kati ya uoanishaji wa kitangulizi na kiolezo, na uwezekano wa kuunganisha kiolezo ni kidogo, na kusababisha msururu wa matatizo kama vile E ya chini na kutoweza kurudiwa vyema.Kupitia utabiri wa programu, ikiwa hakuna shida ya muundo wa sekondari, hiyo itakuwa nzuri.Ikiwa kuna, makala yetu ya ufuatiliaji itajadili hasa jinsi ya kutatua tatizo hili.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotidi

Kwa PCR ya kiasi cha fluorescent, jambo la kwanza unalojitahidi kila siku ni uchimbaji wa RNA, na jambo la pili linaweza kuwa muundo wa primer.
Kwanza kabisa, bado tunaangalia sheria kuhusu muundo wa primer kulingana na orodha ya MIQE.Ni rahisi sana kwamba scumbags inaweza kucheka, na tunaweza kuimaliza kwa sentensi moja: kujua mlolongo na msimamo wa probe ya primer na njia ya kurekebisha.Kwa njia ya utakaso wa primer, usanisi wa primer ni nafuu sana kwa sasa, qPCR inastahili PAGE na juu ya njia za utakaso, na taarifa ya chombo cha awali si muhimu.Watu wengi wamekuwa wakifanya primers kwa miongo kadhaa na hawajui kwamba synthesizer ni ABI3900.
Kuhusu kanuni za uundaji wa utangulizi, si lazima uzikariri kwa kukariri, kwa sababu programu nyingi za usanifu wa kwanza au zana za mtandaoni zinaweza kushughulikia matatizo haya (chombo kilichopendekezwa cha mtandaoni primer3.ut.ee/), na 99.999% ya muundo wa utangulizi haufanyiki kwa mikono Angalia, mwandishi wakati mwingine hutengeneza mamia ya vitangulizi kwa siku, ukiisoma moja baada ya nyingine, itapita moja kwa moja.
Angalia tu pointi zifuatazo baada ya primers kuundwa:
1. Vipengee vya kubuni vilivyo karibu na mwisho wa 3′: Katika kesi ya kutumia primers za oligo dT kwa usanisi wa safu ya kwanza ya cDNA, kwa kuzingatia ufanisi wa unukuzi wa kinyume na uadilifu wa RNA, vianzio vilivyoundwa vinahitaji kutengenezwa karibu na mwisho wa 3 ili kuboresha ufanisi wa ukuzaji .Tumia picha kueleza kama ifuatavyo (hakuna njia ya kuelewa hili):

Kwa nini primers zinapaswa kuundwa karibu na mwisho wa 3, lazima isiwe kweli
2. Thamani ya TM: Thamani ya Tm ni 55-65°C (kwa sababu shughuli ya exonuclease ni ya juu zaidi katika 60°C), na maudhui ya GC ni 40%-60%.
3. MLIPUKO: Ili kuzuia ukuzaji usio maalum wa jenomu, Mlipuko lazima utumike kwa uthibitishaji wa ziada.

Mchakato wa MIQE(7)—qPCR

1. seti ya qPCR
Kwa mujibu wa mahitaji ya MIQE, lazima tueleze wazi hali kamili ya majibu katika makala, ikiwa ni pamoja na usanidi wa mfumo wa majibu ya PCR, ni kit gani kinachotumiwa, ni nani mtengenezaji, mfumo wa majibu ni mkubwa kiasi gani, ikiwa njia ya rangi au njia ya uchunguzi inatumiwa, mipangilio ya programu ya PCR.Madereva wa zamani hakika watapata kuwa mradi tu kit kimechaguliwa, habari iliyo hapo juu imedhamiriwa kimsingi.
Kwa sasa, utengenezaji na uzalishaji wa vifaa vya PCR vya kupima umeme ni teknolojia iliyokomaa sana.Ilimradi hutachagua watengenezaji wabaya sana, uwezekano wa matatizo si mkubwa, lakini bado tunataka kushiriki nawe pointi chache:
Kimeng'enya cha Taq cha kuanza moto:Sehemu muhimu zaidi ya PCR ni kimeng'enya cha Taq cha kuanza moto.Vimeng'enya vya kuanza-moto kwenye soko kwa ujumla vimegawanywa katika aina mbili, moja ni kimeng'enya cha kuanza-moto kilichorekebishwa kwa kemikali (unaweza kufikiria kama upachikaji wa mafuta ya taa), na nyingine ni Je, kimeng'enya cha kuanza-moto cha kurekebisha kingamwili (kinga-kingamwili kinachofunga antijeni).Marekebisho ya kemikali ni njia ya awali ya enzymes zinazoanza moto.Wakati joto fulani linafikiwa, enzyme itatoa shughuli zake.Kimeng'enya cha kuanza-moto kilichobadilishwa na kingamwili hutumia mbinu za kibiolojia kuzuia shughuli ya kimeng'enya.Wakati halijoto fulani inapofikiwa, kingamwili itatolewa na kuamilishwa kama protini, na shughuli ya kimeng'enya itaanzishwa.

Hata hivyo, matumizi ya hii ni nini?Hii ndio kesi, shughuli ya kutolewa kwa enzymes zilizobadilishwa antibody ni kasi zaidi kuliko ile ya enzymes iliyobadilishwa kemikali, kwa hiyo kwa suala la unyeti, enzymes zilizobadilishwa antibody zina faida kidogo, ili kimsingi hakuna enzymes zilizobadilishwa kemikali kwenye kits kwenye soko.Ikiwa kuna, basi teknolojia ya mtengenezaji huyu bado imekwama katika zama za milenia.
Mkusanyiko wa ioni ya magnesiamu:Mkusanyiko wa ioni ya magnesiamu ni muhimu sana katika mmenyuko wa PCR.Mkusanyiko unaofaa wa ioni ya magnesiamu unaweza kukuza kutolewa kwa shughuli ya kimeng'enya cha Taq.Ikiwa ukolezi ni mdogo sana, shughuli za enzyme zitapungua kwa kiasi kikubwa;ikiwa ukolezi ni wa juu sana, ukuzaji usio maalum wa kimeng'enya utaimarishwa.Mkusanyiko wa ioni za magnesiamu pia utaathiri annealing ya primers, joto la kuyeyuka la template na bidhaa za PCR, na hivyo kuathiri mavuno ya vipande vilivyokuzwa.Mkusanyiko wa ioni za magnesiamu kwa ujumla hudhibitiwa kwa 25mM.Bila shaka, kwa kit nzuri, mkusanyiko wa ions magnesiamu lazima kudhibitiwa vizuri.Wafanyabiashara wengine huongeza wakala wa chelating wa ioni ya magnesiamu kwenye kitendanishi, ambacho kinaweza kufikia athari ya urekebishaji wa kiotomatiki wa ukolezi wa ioni ya magnesiamu.
Mkusanyiko wa rangi ya fluorescent:Rangi ya fluorescent, ambayo ni SYBR Green tunayotumia kwa kawaida, huzalisha fluorescence kwa kujifunga kwenye kijito kidogo cha DNA yenye ncha mbili, kwa sababu ufungaji wa rangi kwenye DNA yenye nyuzi mbili sio maalum, hiyo ni kusema, mradi tu DNA iliyo na nyuzi mbili imeunganishwa nayo, DNA inaweza kuunganishwa na kiolezo cha mfumo na kutengeneza fluores kwenye mfumo. tengeneza ishara ya usuli.
PS: Kutokana na sifa zake zinazohimili mwanga, bidhaa sokoni kwa ujumla huwekwa kwenye mirija ya hudhurungi ya centrifuge (kama inavyoonekana kwenye picha hapa chini).Walakini, hii itakutana na shida.Ni vigumu kuona ikiwa kioevu kinanyonywa wakati wa sampuli.Kuhusiana na hili, Qingke ndiyo inayofaa zaidi mtumiaji (kama inavyoonyeshwa kwenye picha hapa chini), na bomba la uwazi limewekwa kwenye mfuko wa bati usio wazi.Kisha kuiweka kwenye mfuko wa bati, kwa kuzingatia urahisi wa kuepuka mwanga na sampuli.Lazima uchague nambari sahihi ya bidhaa.TSE204 ni kuwepo kwa gharama nafuu, ambayo inanifanya nitake kupanda nyasi.

Mkusanyiko wa rangi ya fluorescent pia ni muhimu sana.Ikiwa ukolezi ni mdogo sana, curve ya amplification haitapanda katika hatua ya baadaye na sio kamili;ikiwa ukolezi ni wa juu sana, itasababisha kuingiliwa kwa kelele.Kwa kuwa PCR ya kiasi cha umeme inategemea hasa thamani ya CT, ikiwa mkusanyiko wa rangi ya fluorescent haujarekebishwa vizuri, hatua ya chini ni bora kuliko ya juu.Bila shaka, mkusanyiko unaofaa wa rangi ni bora zaidi.

ROX: Rangi za ROX hutumika kusahihisha hitilafu za mawimbi ya fluorescence vizuri hadi kisima.Watengenezaji wengine wa vifaa wanahitaji urekebishaji, wakati wengine hawana.Kwa mfano, matumizi ya kifaa cha ukuzaji cha Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR kwa kawaida huhitaji urekebishaji, ikijumuisha 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, n.k. Maagizo ya kifurushi cha jumla yataielezea.
Mchanganyiko wa qPCR wa Foregene pia una rangi ya ROX, ambayo ni rahisi kutumia katika mifano mbalimbali.

Wakati Halisi PCR Kit-Taqman

Matibabu dhaifu ya dhamana ya hidrojeni: Matibabu ya vifungo dhaifu vya hidrojeni ni suala la kiufundi.Hakuna kilichosoma miongozo ya vifaa vingi, lakini hakuna hata mmoja wao aliyetaja mada hii.Kwa kweli, ni muhimu sana.Mchanganyiko wa besi hasa inategemea nguvu ya vifungo vya hidrojeni.Vifungo vikali vya hidrojeni ni amplification ya kawaida, na vifungo vya hidrojeni dhaifu husababisha amplification isiyo maalum.Ikiwa vifungo vya hidrojeni dhaifu haviwezi kuondolewa vizuri, amplification isiyo maalum haiwezi kuepukwa.Ndani ya upeo wa mwandishi, makampuni machache tu yameona tatizo hili.Unaponunua kit, unaweza kurejelea ikiwa umezingatia suluhisho katika suala hili kwa kit unayotaka kuchagua.

Kiasi cha majibu: Mfumo wa 20-50ul hutumiwa zaidi, na kiasi kidogo kinaweza kusababisha makosa.Kwa ujumla, maagizo ya kit yatapendekeza matumizi ya kiasi cha majibu ya PCR.Usiwe mwerevu na utumie viwango vidogo ili kuokoa gharama.lengo la.Kiasi kilichopendekezwa na wafanyabiashara kimejaribiwa, na inaweza kuwa kwamba hawawezi kutatua tatizo la makosa yanayosababishwa na kiasi kidogo.
2. Mtengenezaji na nambari ya kifungu cha sahani ya bomba
Kila mtu anajua kanuni ya PCR ya upimaji wa fluorescent.Mkusanyiko wa fluorescence unafanywa hasa kupitia kofia za tube za PCR.Wakati wa kuchagua matumizi ya PCR, makini na pointi mbili: maambukizi ya mwanga mzuri na yanafaa kwa chombo.Kwa ujumla, bodi na zilizopo za bidhaa za kawaida ni sawa, lakini unapaswa kuchagua kwa makini katika suala la kukabiliana, vinginevyo huwezi kutumia chombo.

4. Maarifa ya kiwango cha juu

MIQE (8)—qPCR uthibitishaji
Hiki ndicho kipaumbele cha juu cha qPCR!Mashujaa wengi wameanguka kwenye mchanga hapa.Kwa kweli, inawezekana pia kuwa una bahati na jeni ulizosoma ni rahisi, kwa hivyo ulielea kupitia pango la barafu kando ya upepo.Taarifa ya uthibitishaji wa qPCR inakusudiwa kujaribu kutegemewa kwa data.Tunaorodhesha habari muhimu ya uthibitishaji kama ifuatavyo:

1.Mtihani wa umaalum
Umaalumu wa ukuzaji wa jeni lengwa hujaribiwa kwa kuangalia ikiwa picha ya electrophoresis ni bendi moja;uthibitishaji wa mpangilio;kuyeyuka kwa kiwango ili kuona kama ramani ya kilele ni moja;uthibitishaji wa digestion ya enzyme na njia zingine.
Hapa, tunazingatia tanachanganua upanuzi usio maalum kwa kutumia njia ya kuyeyusha curves.Kwa ujumla, tunapotengeneza vianzio, saizi ya kipande cha bidhaa kinahitajika kuwa kati ya 80-200bp, ambayo hufanya kiwango cha kuyeyuka cha bidhaa ya PCR kuwa 80-85 °C.Kwa hiyo, ikiwa kuna vilele mbalimbali, lazima kuwe na bidhaa nyingine zisizo maalum za kukuza;ikiwa kilele kinaonekana chini ya 80 ° C, kwa ujumla inachukuliwa kuwa primer dimer;ikiwa kilele kinaonekana zaidi ya 85°C, kwa ujumla kinachukuliwa kuwa uchafuzi wa DNA au ukuzaji zaidi Isiyo maalum wa vipande vikubwa.
Kumbuka: Wakati mwingine kuna kilele kimoja tu cha 80°C.Kwa wakati huu, dhana hii inapaswa kuzingatiwa.Kuna uwezekano kwamba matokeo ya ukuzaji ni dimers zote za utangulizi.

Mji wa kawaida wa kuyeyuka (kilele kimoja kisicho na ukuzaji usio maalum)

Mviringo wa kuyeyuka wenye matatizo (ukuzaji usio maalum wa vilele vya uwongo)
【Uchambuzi wa kesi】

Kuna kilele kikuu, lakini primer dimer ni mbaya
Mviringo wa kuyeyuka wa kilele kimoja kwenye takwimu hapa chini unaweza kudanganya macho yako kwa urahisi, ukifikiria kuwa ni jaribio kamili, lakini matokeo sio sawa kabisa.Kwa wakati huu, tunapaswa kuangalia joto la kuyeyuka.Joto la juu ni chini ya 80 ° C, ambayo ni primer-dimer kabisa.

Hakuna kipande kinacholengwa, vipima vya kwanza vyote
Hapa, ndugu yangu hawezi kuacha.Picha hapa chini ni picha iliyopigwa na simu ya mkononi iliyotumwa kwangu na fisadi.Vitendanishi alivyotumia ni chapa zote zinazotumika kwenye tasnia.Alibadilika kutoka chapa moja ya kiambishi cha T hadi chapa nyingine ya kiambishi cha T.Nadhani tayari umeshakisia.Mchafu alinililia: "Kitendanishi kilichotumiwa kwenye picha ya kwanza ni nzuri sana, na kilele ni kimoja.Baadaye, baada ya kutumia kitendanishi ulichopendekeza, inakuwa kama picha ya pili, na kilele kilichochanganywa.Umenifanya kuwa mnyonge."
Tenganisha grafu mbili.Kwa mtazamo wa kwanza, moja ina kilele kimoja, na nyingine ina kilele mara mbili.Upuuzi, kilele kimoja bila shaka ni sawa.Ni kweli?
Mbaya zaidi ya Dou E, nikiweka picha mbili kwenye picha hapa chini, utaelewa mara moja.Kwa kweli, tunapooza kwa urahisi na aina hii ya picha.Baada ya uchambuzi wa makini, tuligundua kwamba: kilele cha takwimu ya kwanza ni saa 75 ° C, ambayo ni primer dimer kabisa;kilele cha takwimu ya pili inaonekana saa 75 ° C na 82 ° C, angalau kuna Bidhaa inaonekana.

Picha za maoni kutoka kwa wanafunzi
Kwa hivyo shida ya msingi sio shida ya vitendanishi, lakini shida ya muundo wa primer.Wakati huo huo, pia inathibitisha kwamba baadhi ya bidhaa kubwa si za ubora wa chuma, na pia inathibitisha kile ndugu yangu alisema kabla: Sio brand ya reagent inayounga mkono makala yako.Ni nakala yako iliyounga mkono chapa ya vitendanishi.Hebu fikiria, ikiwa scumbag haikubadilisha reagents, data mbaya ingetumwa kwenye jarida, na nini kitatokea itakuwa janga.
2. Thamani ya Ct ya udhibiti tupu
Usielezee, ikiwa udhibiti tupu una thamani ya Ct, sio uchafuzi wa mazingira?Walakini, bado unahitaji kuelewa ni udhibiti gani tupu una thamani ya Ct.Ikiwa ni NTC, inamaanisha kuwa kuna DNA ya kigeni kama vile uchafuzi wa kitendanishi.Ikiwa ni NRT, inamaanisha kuwa RNA iliyotolewa ina uchafuzi wa DNA.
3. Curve ya kawaida
Ikiwa ni pamoja na fomula ya mteremko na hesabu, ufanisi wa PCR unaweza kuhesabiwa kupitia fomula.Jaribio kamili linahitaji mteremko wa curve ya kawaida ili kukaribia 3.32, na R² kukaribia 0.9999.
4. Masafa yanayobadilika ya mstari
Masafa yanayobadilika ya maitikio ni ya mstari.Kulingana na kiolezo kinachotumika kuzalisha mkunjo wa kawaida, masafa inayobadilika yanapaswa kujumuisha angalau viwango 5 vya mkusanyiko, na kuzingatia mabadiliko ya thamani za Ct katika viwango vya juu vya viwango vya juu na viwango vya chini vya mkusanyiko.
5. Usahihi wa kugundua
Mabadiliko katika matokeo ya qPCR, yaani, kurudiwa duni, yaani, usahihi duni, husababishwa na mambo mengi, ikiwa ni pamoja na halijoto, ukolezi, na uendeshaji.Usahihi wa qPCR kwa ujumla huwa haudhibitiki kadri nambari ya nakala inavyopungua.Kimsingi utofauti wa kimajaribio, utofauti huu wa kiufundi unapaswa kuwa tofauti na utofauti wa kibayolojia, na nakala za kibayolojia zinaweza kushughulikia moja kwa moja tofauti za takwimu katika matokeo ya qPCR kati ya vikundi au matibabu.Hasa kwa ajili ya majaribio ya uchunguzi, usahihi bora zaidi wa majaribio (uwezekano wa kujirudia) kwenye tovuti na waendeshaji lazima kuripotiwa.
6. Ufanisi wa kugundua na LOD (katika multiplex qPCR)
LOD ndio ukolezi wa chini kabisa wa 95% ya sampuli chanya zilizogunduliwa.Kwa maneno mengine, mkusanyiko wa LOD iliyo ndani ya seti ya nakala za jeni lengwa haipaswi kuzidi 5% ya miitikio iliyoshindwa.Wakati wa kufanya uchanganuzi wa multiplex qPCR, hasa kwa ajili ya ugunduzi wa wakati mmoja wa mabadiliko ya pointi au upolimishaji, multiplex qPCR inahitaji kutoa ushahidi kwamba usahihi wa vipande vingi vinavyolengwa hauathiriwi katika mirija moja, ugunduzi wa nyingi na ugunduzi wa bomba moja Ufanisi na LOD zinapaswa kuwa sawa.Hasa wakati jeni lengwa la umakini wa hali ya juu na jeni lengwa la mkazo wa chini hukuzwa kwa wakati mmoja, shida hii lazima izingatiwe.
Matatizo na ufumbuziKwa ujumla, shida zinazokutana mara nyingi katika utatuzi wa qPCR huzingatia mambo yafuatayo:
· Ukuzaji usio maalum
·Uchaguzi mgumu wa mkusanyiko wa primer na shida na primer-dimers
·Kiwango cha joto cha aneal si sahihi
·Muundo wa pili huathiri ufanisi wa ukuzaji
ukuzaji usio maalum
ukuzaji usio maalumhutokea , kwa ujumla inazingatiwa ikiwa muundo wa primer haufai, lakini ikiwa huna haraka ya kubadilisha primers, unaweza kujaribu njia zifuatazo kwanza (kanuni pia imeunganishwa):
·Kuongeza halijoto ya kupunguza joto – jaribu kufanya vifungo hafifu vya hidrojeni vishindwe kutunza;
·Kufupisha muda wa kunyonya na kurefusha - punguza uwezekano wa vifungo dhaifu vya hidrojeni;
·Punguza mkusanyiko wa utangulizi - kupunguza uwezekano wa kufunga vianzio visivyohitajika na maeneo yasiyolengwa;
Ufanisi wa chini wa amplification
Hali iliyo kinyume na ukuzaji usio maalum - ufanisi mdogo wa ukuzaji , na hatua za kukabiliana na ufanisi mdogo wa ukuzaji ni kinyume chake:
·Kuongeza muda wa kunyonya na kurefusha;
·Badilisha hadi PCR ya hatua tatu na upunguze halijoto ya kuchubua;
· Kuongeza mkusanyiko wa primer;
Ps: Wanafunzi wengi waliohitimu waliozaliwa katika miaka ya 90 hawataki kusoma jinsi ya kurekebisha majaribio, na wanatumai kuwa kit kinaweza kutatua shida kabisa (ikiwa unataka kwenda kwa kampuni ya kitendanishi kufanya utafiti na maendeleo baada ya kuhitimu), kwa kweli, watengenezaji wa vitendanishi pia wanafikiria hivi, natumai ni mjinga Inaweza kutumika unapoipata, kwa hivyo watengenezaji wa vitendanishi wametumia juhudi nyingi katika kutatua shida, pamoja na kusuluhisha shida. Vipengele vya kunyonya vya H-bondi.Ili kutatua tatizo kwa urahisi, wapumbavu bado wanapaswa kusoma kuanzishwa kwa kampuni ya reagent ili kuona ikiwa kuna sababu ambayo inachukua vifungo vya hidrojeni dhaifu.
Uchaguzi mgumu wa mkusanyiko wa primer na shida na primer-dimers
Mbinu 1: Kwa ujumla, maagizo ya vifaa vya qPCR yamependekeza mifumo na viwango vya msingi vilivyopendekezwa.
Mbinu 2: Utatuzi kwa kuweka upinde rangi wa ukolezi wa primer.Picha hapa chini imeibiwa kutoka kwa kampuni ili kuonyesha.Kielelezo kilicho hapa chini kinaonyesha matokeo ya kiasi cha mwanga wa mwanga wa mwanga wa umeme yaliyofanywa kwa viwango vitatu vya ukolezi vya primer (100nM, 250nM, 500nM) na violezo vinne vya mkusanyiko (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Thamani ya Ct ya matokeo ya majaribio imepangwa kama ifuatavyo:

Uteuzi wa Kuzingatia Kwanza Unganisha kila mkusanyiko wa kianzio kwenye mstari kama ifuatavyo:

Chaguo la mkusanyiko wa primer ni dhahiri, uhusiano wa mstari wa mkusanyiko wa primer wa 100nM na 250nM ni bora zaidi, na uhusiano wa mstari wa mkusanyiko wa primer wa 500nM ni duni.Katika 100nM na 250nM, thamani ya Ct ya 250nM ni ndogo, hivyo mkusanyiko bora wa primer ni 250nM.Kwa ujumla primer-dimers kali inaweza kuonekana katika curve kuyeyuka.Je, ikiwa primers zilizoundwa haziwezi kuepuka primer-dimers?
Mbinu 3: Kupunguza kiasi cha primers na kuongeza joto annealing (hakuna haja ya kueleza).
Thamani ya majaribio ya joto la annealing ni 60 ° C.Ikiwa huna uhakika, jinsi ya kuchagua hali ya joto inayofaa zaidi ya annealing?Jibu ni sawa na uchaguzi wa mkusanyiko wa primer -mtihani wa gradient.Piga picha kutoka kwa kampuni ya Bio-rad ili kuonyesha tatizo.Kwa ukuzaji wa kipande fulani cha lengo, weka viwango vya joto nane, kila moja ikiwa na marudio matatu, na curve ya ukuzaji iliyopatikana ni kama ifuatavyo.

uteuzi wa hali ya joto:
· 70 ° C, 69 ° C - Kimsingi, primers haiwezi kuunganishwa, kwa hiyo hakuna amplification.
· 67.3 ° C - Kuna kiasi kidogo cha amplification mwanzoni, na thamani ya Ct ni kiasi kikubwa.
·64.5°C——Thamani ya Ct inapungua.
·Katika 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, na 55.0°C, thamani za Ct kimsingi zilielekea kuwa thabiti, lakini thamani za mwisho za fluorescence zilikuwa tofauti.
Jinsi ya kuchagua?Kanuni: Kanuni ya kwanza ni thamani ya juu ya Ct.Kwa thamani sawa ya Ct, chagua halijoto ya juu zaidi ili kuzuia kuzidisha na ukuzaji usio maalum.Ingawa kuna thamani ya juu ya fluorescence katika 55 ° C, kunaweza kuwa na dimers au ukuzaji usio maalum ndani yake.
Lakini kama wewe ni mwerevu kama wewe, hakika utafikiri: Kuzungumza kimantiki, ikiwa majibu ya PCR ni mahususi sana, mradi tu ukolezi wa primer unazidi mahitaji ya chini, pointi za juu na za chini zisiwe na athari, kama vile rangi za fluorescent na dNTPs.Hakika, mradi tu halijoto ya anneal imeboreshwa ipasavyo, athari ya mkusanyiko wa primer kwenye thamani ya Ct itapunguzwa kwa kawaida.

Halijoto ya annealing imeboreshwa ipasavyo, na athari ya mkusanyiko wa primer kwenye CT itapunguzwa
Muundo wa sekondari huathiri ufanisi wa ukuzaji
Wacha tuchukue picha kutoka kwa Bio-rad ili kuonyesha shida.Pia huunda kipenyo cha halijoto ili kukuza jeni na muundo wa pili.

Muundo wa sekondari hujitokeza
Inaweza kuonekana kuwa wakati kiwango cha joto kinapungua, bidhaa huanza kuonekana na thamani ya Ct inasonga mbele, kufikia thamani ya chini ya 60.7 ° C, na kisha gradient ya joto inapungua, thamani ya Ct inakuwa kubwa.Kinyume chake, joto linapoongezeka, muundo wa sekondari unafungua na ufanisi wa amplification huongezeka.Baada ya kufikia joto fulani, kuongeza joto hakuwezi kuboresha ufanisi wa amplification.Kwa sababu primers haziwezi kuunganishwa kwa utulivu kwa wakati huu.Kwa hiyo,tafuta halijoto iliyo na thamani ya chini kabisa ya Ct, ambayo ni joto bora kwa kuimarisha template ya muundo wa sekondari!Bila shaka, wapumbavu wenye akili wanapaswa kujua kwamba ikiwa sio lazima, ni bora kubadili primers na kuepuka kanda ya muundo wa sekondari.
5. Kiwango cha maombi
MIQE—Uchambuzi wa Data

Uchambuzi wa data hutolewa hasa na kifaa cha kupima umeme cha PCR.Katika makala iliyotangulia, kazi nyingi za uchambuzi wa data zimefanywa, kama vile udhibiti tupu, ambao umeelezewa katika muundo wa jaribio.Jeni za kumbukumbu za ndani, nambari za kurudia, n.k. zimefafanuliwa., hapa tunaelezea hasa matumizi ya qPCR.
qPCR hutumiwa sana, na uthibitishaji wa majaribio na utambuzi wa asidi ya nukleiki ndio hali zinazotumika sana.
quantification kamili
Logi (mkusanyiko wa awali) ina uhusiano wa mstari na idadi ya mizunguko.Curve ya kawaida inaweza kuchorwa kutoka kwa kiwango na nambari ya nakala ya awali inayojulikana, ambayo ni, uhusiano wa mstari wa mmenyuko wa ukuzaji unaweza kupatikana.Kulingana na thamani ya Ct ya sampuli, mkusanyiko katika sampuli unaweza kuhesabiwa.Kiasi cha violezo vya kujumuisha.

Mbinu Kabisa ya Kukokotoa Kiasi
Ukadiriaji kamili lazima uzingatie curve ya kawaida.Ili kutengeneza curve ya kawaida, kiwango kinahitajika.Kawaida, kiwango ni plasmid inayopatikana kwa kuunda jeni inayolengwa.Kwa nini ni plasmid?Kwa sababu DNA ya plasmid ya mviringo ndiyo imara zaidi.Punguza bidhaa ya kawaida katika gradient 5 hadi 6 kulingana na uwiano wa mara mbili (dilution mara 10), na uzingatia usawa wakati wa kufuta.Acha thamani ya Ct iwe kati ya 15-30.

Maandalizi ya kawaida
Wakati huo huo, sampuli ya kujaribiwa inapaswa pia kupunguzwa ipasavyo (kumbuka sababu ya dilution), na thamani ya Ct inapaswa pia kuanguka kati ya 15-30.Bidhaa ya kawaida + sampuli ya kujaribiwa huwekwa kwenye mashine pamoja.Baada ya kukimbia, curve ya kawaida ilitengenezwa kwa dutu ya kawaida, na sampuli za kujaribiwa zililetwa kwenye curve ya kawaida ili kuhesabu mkusanyiko.
Ukadiriaji wa virusi vya Hepatitis B HBV ni hesabu kamili ya kawaida, ambayo inaweza kuhesabu nambari ya nakala ya virusi katika 1ml ya damu.
Uhesabuji wa nambari ya nakala
Sampuli ya mkusanyiko itajaribiwa (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × kipengele cha dilution
Sampuli ya uzito wa Masi = idadi ya besi × 324
Nambari ya nakala ya sampuli itakayojaribiwa (nakala/ul) = mkusanyiko wa sampuli itakayojaribiwa / uzito wa molekuli ya sampuli × 6 × 1014

Njia ya kuhesabu nambari ya nakala

Hapo juu ni njia ya hesabu ya kuamua wingi.Hili ni tatizo la hisabati ambalo linaweza kutatuliwa baada ya kuhitimu kutoka shule ya upili ya junior, na matatizo ya hisabati kwa ujumla hutatuliwa na kompyuta.Ikiwa hauelewi, unaweza kuja kuwasiliana.
quantification ya jamaa
Ukadiriaji jamaa hutumika hasa katika utafiti wa kisayansi.Kuna virusi ngapi katika 1ml ya damu, na ni virusi vya DNA, hii ni tukio la kiasi kikubwa cha kuamua: kiasi cha damu kinaweza kuamua, na virusi vya DNA ni imara.Walakini, ni ngumu kwetu kulinganisha idadi ya nakala za nakala za jeni fulani kwenye jani, kwa sababu ni ngumu kuamua saizi, uzito, na upole wa jani, ni ngumu kuamua kiasi cha RNA iliyotolewa, na ufanisi wa unukuzi wa kinyume pia ni ngumu kuamua, ambayo ni kusema, hatua yoyote inaweza kufanya data ya majaribio kuwa na mende na haiwezi kutumika.
Kwa hivyo, hesabu ya jamaa lazima ianzishe kipengele:jeni la kumbukumbu la ndani.
Kwa maneno mengine, ukadiriaji wa jamaa kwa kweli ni ulinganisho kati ya jeni lengwa na jeni la marejeleo ya ndani.Ikilinganishwa katika tishu sawa na seli moja, ushawishi wa ukubwa wa sampuli, kiasi cha uchimbaji wa RNA, ufanisi wa unukuzi wa kinyume, na ufanisi wa PCR ni mdogo kiasi.Kwa sababu ya saizi ndogo ya sampuli, jeni za kumbukumbu za ndani na jeni lengwa zilipunguzwa kwa kiasi.Ndio maana tumekuwa tukisisitiza usawa na utulivu hapo awali.
Jeni za kumbukumbu za ndani kwa ujumlajeni za utunzaji wa nyumba( jeni za kutunza nyumba), ambazo hurejelea tabaka la jeni ambalo limeonyeshwa kwa uthabiti katika seli zote, na bidhaa zao ni muhimu ili kudumisha shughuli za kimsingi za maisha ya seli.
Usichanganye dhana hii.Jeni za utunzaji wa nyumba ni masharti ya utendaji wa kibayolojia, wakati jeni za marejeleo ya ndani ni masharti ya kiufundi ya majaribio.Jeni za utunzaji wa nyumba zinahitaji kupitisha uthibitishaji kabla ya kuchaguliwa kama jeni za marejeleo ya ndani.
Kwa mfano, tulichagua jeni kadhaa za utunzaji wa nyumba katika mchoro ulio hapa chini ili kupima viwango vyao vya kujieleza katika seli tofauti za tishu, na tukagundua kuwa viwango vya kujieleza vya β-2-microglobulini vilikuwa tofauti kabisa na vile vya jeni nyingine tatu, kwa hivyo hazingeweza kutumika kama jeni za marejeleo ya ndani.

Baada ya kuelewa kazi ya urekebishaji wa jeni la kumbukumbu ya ndani, algorithms mbili zinatokana na kuanzishwa kwa jeni la kumbukumbu ya ndani.
· Mbinu ya curve ya kawaida mara mbili
·2 – △△Mbinu ya CT (njia ya kulinganisha thamani ya CT)
Iwapo ungependa kusoma spishi na utendaji wa jeni, tafadhali acha utafiti wa algoriti na utumie fomula moja kwa moja, au tumia mashine moja kwa moja;kama wewe ni mvulana mnyoofu katika hisabati na uhandisi, tafadhali jisikie huru.
njia ya curve ya kawaida mara mbili
Kadiria jeni lengwa na jeni la utunzaji wa nyumba la sampuli ya udhibiti na sampuli ya kujaribiwa kupitia mkunjo wa kawaida, na kisha ukokote thamani inayolingana kulingana na fomula ya hesabu, ambayo ni kiwango cha msemo wa jamaa.
Manufaa: uchambuzi rahisi, uboreshaji rahisi wa majaribio
Hasara: Kwa kila jeni, kila mzunguko wa majaribio lazima utengeneze mkunjo wa kawaida
Utumiaji: Mojawapo ya njia mbili zinazotumiwa sana na zinazotambulika za ujamaa katika utafiti wa udhibiti wa usemi wa jeni.
Formula ni kama ifuatavyo:

Mifano ni kama ifuatavyo:

Hesabu kiasi cha jamaa kulingana na matokeo ya kiasi
2 – △△Mbinu ya CT (njia ya kulinganisha thamani ya CT)

Manufaa: Hakuna haja ya kutengeneza curve ya kawaida
Hasara: Inachukuliwa kuwa ufanisi wa amplification ni karibu na 100%;kupotoka kwa kawaida ni <5%, na curve ya kawaida na ufanisi kati ya kila amplification inadhaniwa kuwa thabiti;uboreshaji wa hali ya majaribio ni ngumu zaidi.
Utumiaji: Mojawapo ya njia mbili zinazotumiwa sana na zinazotambulika za ujamaa katika utafiti wa udhibiti wa usemi wa jeni.

Bila shaka, ufanisi wa ukuzaji kwa kawaida hauwezekani kuwa kikamilifu 1. Mbinu ya kusahihisha: Ikiwa tunajua kwamba jeni lengwa na jeni la kumbukumbu vina ufanisi sawa wa ukuzaji, lakini ufanisi wa ukuzaji si sawa na 1, basi 2△△Ct inaweza kusahihishwa kama: (1+E )－△△ Ct, kwa mfano, uboreshaji wa 0 inaweza kusahihishwa, kwa mfano, uboreshaji wa 0 unaweza kusahihishwa. 1.95－△△Ct
Kufikia sasa, maudhui kuhusu PCR ya kiasi cha fluorescent yamefikia mwisho.