Escherichia coli O157:H7 Kifaa cha Kugundua Asidi ya Nyuklia (Njia ya Uchunguzi wa Fluorescent ya PCR)
Maelezo ya Kiti:
Paka.Nambari.FP102
Hutumika kugundua na kukagua haraka E. coli O157:H7 katika chakula, malisho, sampuli za maji na sampuli za mazingira.
Maelezo
Hutumika kutambua na kukagua haraka E. coli O157:H7 katika vyakula, malisho, sampuli za maji na sampuli za kimazingira.
[Kanuni ya majaribio]Kulingana na kanuni ya teknolojia ya PCR ya umeme, vianzio maalum na vichunguzi vya Taqman vimeundwa kwa ajili ya jeni mahususi ya Escherichia coli O157: H7, na kutambuliwa na kifaa cha umeme cha PCR, ili kutambua utambuzi wa Escherichia coli O157: H7 Utambuzi wa ubora wa DNA.
Yaliyomo kwenye Vifaa
Kumbuka: uchunguzi wa kituo cha ROX haujajumuishwa.
| Cwapinzani | Vipimo | Qumoja |
| Bafa A | Mrija | 1 |
| Bafa B | Mrija | 1 |
| Udhibiti mzuri | Mrija | 1 |
| Udhibiti hasi | Mrija | 1 |
Matumizi Yanayotarajiwa
Inatumika kwa utambuzi wa haraka na uchunguzi wa E. koli O157:H7 katika chakula, malisho, sampuli za maji na sampuli za mazingira.
Masharti ya Uhifadhi na Tarehe ya Kuisha
Hifadhi kwa -20 ℃ kwenye giza na epuka kuganda na kuyeyusha mara kwa mara.
Muda wa uhalali ni 12miezi, na tarehe ya uzalishaji imeonyeshwa kwenye ufungaji wa nje.
Vyombo na Matumizi
Chombo cha PCR cha fluorescent, bunduki ya pipette na vidokezo vinavyolingana, shaker ya vortex, mini centrifuge.
Matumizi
1. Uchakataji wa Sampuli
1.1 Aina ya Sampuli: Seti hii inafaa kwa chakula, malisho, sampuli za maji na sampuli zingine zinazoshukiwa kuambukizwa na Escherichia coli O157:H7.Kwa bidhaa za nyama za kusindika, vinywaji na vitu vingine vyenye rangi, vinahitaji kusafishwa ili kuepuka kuathiri mkusanyiko wa ishara za fluorescence.
1.2 Uchakataji wa sampuli: Rejelea "Mtihani wa Kitaifa wa Usalama wa Chakula wa GB 4789.10-2016 wa Mikrobiologia wa Kitaifa wa Chakula wa Escherichia coli O157: H7" kwa utayarishaji wa sampuli, utamaduni wa kuimarisha na kutenga Escherichia coli O157: H7.
- Nuchimbaji wa asidi ya ucleic
Chukua mililita 20 za mmumunyo wa urutubishaji kwenye bomba la centrifuge la mililita 1.5, ongeza 200 μL ya lysate ya vijidudu (kifaa cha ziada kinahitajika), vortex kwa sekunde 30, centrifuge kwa muda mfupi, na weka kando.
Maelezo: Uchimbaji wa asidi ya nucleic kutoka kwa lysate unapaswa kukamilika ndani ya dakika 10, na hauwezi kuhifadhiwa kwa muda mrefu.
3. Kukuza Asidi ya Nucleic
3.1 Washa kifaa cha kupima umeme cha PCR kwa matumizi.
Buffer A na Buffer B kutoka kwa kit , viyeyushe vizuri, na centrifuge kwa muda mfupi.Ongeza 18 μL Buffer A na 2 μL Buffer B kwa kila mirija ya majibu ya PCR.Kisha ongeza mililita 5 kwa kila kidhibiti hasi, asidi nucleic iliyotolewa, na udhibiti chanya kwenye mirija ya athari ya PCR, funga mirija na centrifuge kwa muda mfupi.
3.3 Hamisha bomba la mmenyuko la PCR kwenye mashine ya PCR ya umeme , na utumie taratibu zifuatazo kufanya majaribio ya ukuzaji : chagua mililita 25 kwa mfumo wa mmenyuko , kusanya mawimbi ya umeme ifikapo 60°C kwa kila mzunguko, na uchague FAM kwa ajili ya chaneli ya utambuzi.
| Hatua | Mpango | Idadi ya mizunguko |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60 ℃ 30s (kukusanya fluorescence) |
Miongozo ya uchambuzi wa shida
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Hakuna RNA inayoweza kutolewa au mavuno ya asidi ya nucleic ni ya chini
Kwa kawaida kuna mambo mengi yanayoathiri ufanisi wa urejeshaji, kama vile: sampuli ya maudhui ya RNA, njia ya uendeshaji, sauti ya kufafanua, n.k..
Uchambuzi wa sababu za kawaida:
1. Umwagaji wa barafu au joto la chini (4 ° C) centrifugation wakati wa operesheni.
Pendekezo: Joto la chumba (15-25 ° C) operesheni, kamwe umwagaji wa barafu na centrifuge ya joto la chini.
2. Uhifadhi usiofaa wa sampuli au uhifadhi wa sampuli kwa muda mrefu sana.
Pendekezo: Hifadhi sampuli kwa -80 ° C au zigandishe kwenye nitrojeni ya kioevu, na uepuke matumizi ya kufungia mara kwa mara;jaribu kutumia sampuli mpya zilizokusanywa kwa uchimbaji wa RNA.
3.Uchambuzi wa sampuli usiotosha
Pendekezo: Tafadhali hakikisha kwamba sampuli na suluhisho la kufanya kazi (Linear Acrylamide) vimechanganywa vizuri na kuangaziwa kwa dakika 10 kwenye joto la kawaida (15-25 ° C)
4. Kielelezo kiliongezwa kimakosa
Pendekezo: Hakikisha kuwa RNase-Free ddH2O imeongezwa katikati ya utando wa safu wima ya utakaso.
5.Kiasi kisichofaa cha ethanoli isiyo na maji katika Buffer viRW2
Pendekezo: Tafadhali fuata maagizo, ongeza kiasi sahihi cha ethanoli isiyo na maji kwenye Buffer viRW2 na uchanganye vizuri kabla ya kutumia kit.
6.Matumizi yasiyofaa ya sampuli.
Pendekezo: 200µl ya sampuli kwa 500μl ya Buffer viRL.Kiwango cha sampuli kupita kiasi kitasababisha kupunguza kasi ya uchimbaji wa RNA.
7.Ujazo usiofaa wa kufichua au ufinyu usio kamili.
Pendekezo: Kiasi kisichojulikana cha safu ya utakaso ni 30-50μl;ikiwa athari ya elution hairidhishi, inashauriwa kuongeza ddH isiyo na joto ya RNase-Free.2O na kuongeza muda wa kuweka kwenye joto la kawaida, kama vile 5-10min
8. Safu wima ya utakaso ina mabaki ya ethanoli baada ya kusuuza kwenye Buffer viRW2.
Pendekezo: Iwapo ethanoli bado itasalia baada ya kusuuza katika Buffer viRW2 na upenyezaji wa mirija tupu kwa dakika 2, safu wima ya utakaso inaweza kuachwa kwenye joto la kawaida kwa dakika 5 baada ya kupenyeza kwa mrija tupu ili kuondoa kikamilifu ethanoli iliyobaki.
Uharibifu wa molekuli za RNA zilizosafishwa
Ubora wa RNA iliyosafishwa unahusiana na vipengele kama vile hifadhi ya sampuli, uchafuzi wa RNase na uendeshaji.
Uchambuzi wa sababu za kawaida:
1.Sampuli zilizokusanywa hazikuhifadhiwa kwa wakati.
Pendekezo: Ikiwa sampuli haitatumiwa kwa wakati baada ya kukusanywa, tafadhali ihifadhi kwa -80 ℃ au nitrojeni kioevu mara moja.Kwa uchimbaji wa molekuli za RNA, jaribu kutumia sampuli mpya zilizokusanywa kila inapowezekana.
2.Sampuli zilizokusanywa zilikuwa zikiganda na kuyeyushwa mara kwa mara.
Pendekezo: Epuka kufungia mara kwa mara na kuyeyusha (si zaidi ya mara moja) wakati wa kukusanya na kuhifadhi sampuli, vinginevyo mavuno ya asidi ya nucleic yatapungua.
3.RNase ilianzishwa katika chumba cha uendeshaji au hakuna glavu za kutosha, masks, nk.
Pendekezo: Uchimbaji wa jaribio la molekuli za RNA hufanywa vyema zaidi katika chumba tofauti cha utendakazi cha RNA, na jedwali la majaribio husafishwa kabla ya jaribio.Vaa glavu na vinyago vinavyoweza kutupwa wakati wa jaribio ili kuepuka uharibifu wa RNA unaosababishwa na utangulizi wa RNase.
4.Kitendanishi kimechafuliwa na RNase wakati wa matumizi.
Pendekezo: Badilisha na Viral RNA Isolation Kit mpya kwa majaribio yanayohusiana.
5. Uchafuzi wa RNase wa mirija ya katikati, vidokezo vya bomba, n.k. Pendekezo: Hakikisha kwamba mirija ya katikati, vidokezo vya bomba, na bomba zote hazina RNase.
Molekuli za RNA zilizosafishwa ziliathiri majaribio ya chini ya mkondo
Molekuli za RNA zilizosafishwa kwa safu wima ya utakaso zitaathiri majaribio ya mkondo wa chini ikiwa kuna ayoni au protini nyingi za chumvi, kama vile: unukuzi wa kinyume, Northern Blot, n.k..
1.Kuna ioni za chumvi zilizosalia katika molekuli za RNA zilizotolewa.
Pendekezo: Hakikisha kwamba kiasi sahihi cha ethanoli isiyo na maji kimeongezwa kwenye Buffer viRW2, na uoshe safu ya utakaso mara mbili kulingana na kasi sahihi ya kupenyeza kwenye maagizo ya uendeshaji; Ikiwa bado kuna ioni za chumvi zilizobaki, unaweza kuongeza Buffer viRW2 kwenye safu ya utakaso, na kuiacha kwenye joto la kawaida kwa dakika 5.Kisha fanya centrifugation ili kuondoa uchafuzi wa ioni za chumvi kwa kiwango kikubwa
2.Kuna ethanoli iliyobaki katika molekuli za RNA zilizotolewa
Pendekezo: mara tu unapothibitisha kuwa safu wima za utakaso zimeoshwa na Buffer viRW2, fanya uingizaji hewa wa bomba tupu kulingana na kasi ya centrifugal kwenye maagizo ya uendeshaji.Ikiwa bado kuna ethanol iliyobaki, inaweza kushoto kwa dakika 5 kwa joto la kawaida baada ya centrifugation ya tube tupu ili kuondoa ethanol iliyobaki kwa kiwango kikubwa zaidi.
Miongozo ya Maagizo:
Mwongozo wa Maagizo ya Vifaa vya Kutengwa vya RNA ya Virusi
