Tumekuwa na uzoefu mtengenezaji.Kushinda wengi katika uidhinishaji muhimu wa soko lake kwa punguzo kubwa la China High Sensitivity Hatua Moja Rt-QpcrKit V2, Ubora ni maisha ya kiwanda, Zingatia mahitaji ya mteja ndio chanzo cha kuishi na maendeleo ya kampuni, Tunafuata uaminifu na mtazamo mzuri wa kufanya kazi, tunatarajia ujio wako!
Tumekuwa na uzoefu mtengenezaji.Kushinda wengi katika uthibitisho muhimu wa soko lake kwaChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Kampuni yetu inaahidi: bei nzuri, muda mfupi wa uzalishaji na huduma ya kuridhisha baada ya mauzo, pia tunakukaribisha kutembelea kiwanda chetu wakati wowote unapotaka.Natamani sasa tuwe na biashara ya kupendeza na ya muda mrefu pamoja !!!

Maelezo

Seti hii hutumia mfumo wa kipekee wa akiba ya lysis ambao unaweza kutoa kwa haraka RNA kutoka kwa sampuli za seli zilizoboreshwa kwa miitikio ya RT-qPCR, na hivyo kuondoa mchakato wa utakaso wa RNA unaotumia muda na mtamu.Kiolezo cha RNA kinaweza kupatikana kwa dakika 7 tu.5×Direct RT Mix na 2×Direct qPCR Mix-SYBR vitendanishi vilivyotolewa na kit vinaweza kupata matokeo ya muda halisi ya PCR kwa haraka na kwa ufanisi.

5×Direct RT Mix na 2×Direct qPCR Mix-SYBR zina ustahimilivu mkubwa wa vizuizi, na lysate ya sampuli inaweza kutumika kama kiolezo cha RT-qPCR moja kwa moja.Seti hii ina nakala ya kipekee ya RNA yenye mshikamano wa hali ya juu Foregene reverse transcriptase, na Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, bafa ya majibu, kiboreshaji cha PCR na kidhibiti.

Vipimo

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Vipengele vya kit

Vipengele&faida

■ Rahisi na bora : kwa kutumia teknolojia ya Cell Direct RT, sampuli za RNA zinaweza kupatikana kwa dakika 7 pekee.

■ Sampuli ya mahitaji ni ndogo, hadi seli 10 zinaweza kujaribiwa.

■ Utoaji wa juu: inaweza kutambua kwa haraka RNA katika seli zilizokuzwa katika sahani 384, 96, 24, 12, 6 za visima.

■ Kifutio cha DNA kinaweza kuondoa haraka jenomu zilizotolewa, kupunguza kwa kiasi kikubwa athari kwenye matokeo ya majaribio yanayofuata.

■ Mfumo wa RT na qPCR ulioboreshwa hufanya unukuzi wa RT-PCR wa hatua mbili kuwa bora zaidi na PCR mahususi zaidi, na sugu zaidi kwa vizuizi vya majibu ya RT-qPCR.

Programu ya kit

Upeo wa maombi: seli za utamaduni.

- RNA iliyotolewa kwa sampuli ya uchanganuzi: inatumika tu kwa kiolezo cha RT-qPCR cha kifaa hiki.

- Seti hii inaweza kutumika kwa madhumuni yafuatayo: uchanganuzi wa usemi wa jeni, uthibitishaji wa athari ya kunyamazisha jeni ya siRNA, uchunguzi wa dawa, n.k.

Mchoro

Uhifadhi na maisha ya rafu

Sehemu ya I ya kifaa hiki inapaswa kuhifadhiwa kwa 4℃;Sehemu ya II inapaswa kuhifadhiwa kwa -20 ℃.

Foregene Protease Plus II inapaswa kuhifadhiwa kwa 4℃, isigandishe kwa -20℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR inapaswa kuhifadhiwa kwa -20℃ kwenye giza;ikitumiwa mara kwa mara, inaweza pia kuhifadhiwa kwa 4℃ kwa hifadhi ya muda mfupi (tumia ndani ya siku 10).Tumekuwa na uzoefu wa mtengenezaji.Kushinda wengi katika vyeti muhimu vya soko lake kwa punguzo Kubwa la China High Sensitivity Hatua Moja Rt-Qpcr Kit V2, Ubora ni maisha ya kiwanda, Zingatia mahitaji ya mteja ndio chanzo cha maisha na maendeleo ya kampuni, Tunafuata uaminifu na mtazamo mzuri wa kufanya kazi, tunatarajia ujio wako!
Punguzo kubwaChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Kampuni yetu inaahidi: bei nzuri, muda mfupi wa uzalishaji na huduma ya kuridhisha baada ya mauzo, pia tunakukaribisha kutembelea kiwanda chetu wakati wowote unapotaka.Natamani sasa tuwe na biashara ya kupendeza na ya muda mrefu pamoja !!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Kwa seli moja kwa moja RT-qPCR kwa kutumia ≤ seli 1000,000

Utangulizi wa bidhaa

Bidhaa hii hutumia mfumo wa kipekee wa akiba ya lysis ili kutoa kwa haraka RNA kutoka kwa sampuli za seli zilizotengenezwa kwa miitikio ya RT-qPCR, kuondoa mchakato unaotumia muda na unaosumbua wa utakaso wa RNA, na dakika 7 pekee ili kupata kiolezo kinachohitajika cha RNA, kwa kutumia Mchanganyiko wa 5× Direct RT, 2× Direct qPCR Mix-Taqman inayotolewa na kifurushi cha muda halisi cha matokeo.

5× Direct RT Mix na 2× Direct qPCR Mix-Taqman zina ustahimilivu mkubwa wa vizuizi na zinaweza kufanya urejeshaji bora na ukuzaji mahususi kwa kutumia lilisati ya sampuli itakayopimwa kama kiolezo.Kitendanishi kina Foregene Reverse Transcriptase, Moto D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer na Stabilizer, ambayo inaweza kutumika pamoja na lysis buffer kutambua kwa haraka na kwa urahisi sampuli, na ina sifa za unyeti wa juu, umaalumu na uthabiti.

Vipengele vya bidhaa

Teknolojia rahisi na bora ya Cell Direct RT ambayo inachukua kama dakika 7 kupata sampuli za RNA.

Mahitaji ya sampuli ni madogo, na kiwango cha chini cha seli 10 zilizokuzwa zinaweza kutumika kwa majaribio.

Usambazaji wa juu wa upataji wa haraka wa RNA wa seli zilizokuzwa kama vile sahani 384, 96, 24, 12, na 6-visima.

Kifutio cha DNA kinaweza kuondoa haraka jenomu zilizotolewa, hivyo kupunguza kwa kiasi kikubwa athari kwenye matokeo ya majaribio yanayofuata.

Mifumo iliyoboreshwa ya RT na qPCR huwezesha RT-PCR ya hatua mbili yenye unukuzi mzuri zaidi wa kurudi nyuma, umaalumu, na ustahimilivu mkubwa wa vizuizi vya RT-qPCR.

Programu ya kit

Upeo wa matumizi: Seli zilizoundwa.

Sampuli ya uchanganuzi iliyotafsiriwa RNA: inatumika tu kama kiolezo cha RT-qPCR cha hatua mbili.

Vifaa vinaweza kutumika kwa madhumuni yafuatayo: uchambuzi wa udhibiti wa jeni, upimaji wa aleli, uchunguzi wa madawa ya kulevya, nk.

Mapungufu ya vifaa

Vipande vilivyoimarishwa ≤ 300 bp.

Vifaa hutumiwa kwa seli mpya za kitamaduni.

Udhibiti wa ubora wa bidhaa

Kulingana na Mfumo wa Jumla wa Kudhibiti Ubora wa FOREGENE, kila kundi la vifaa vya mfululizo vya Cell Direct RT-qPCR hujaribiwa kwa ukali mara nyingi ili kuhakikisha kutegemewa na uthabiti wa ubora wa kila kundi la vifaa.

Yaliyomo kwenye vifaa

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman inaweza kununuliwa kando, maelezo yametolewa katika Kiambatisho 1 (UKURASA WA 13).

Masharti ya kuhifadhi

1. Masharti ya Usafirishaji

Mchakato mzima wa usafirishaji wa sanduku la pakiti ya barafu ya halijoto ya chini, ili kuhakikisha kuwa vifaa viko katika hali ya <4 °C.

2. Hali ya kuhifadhi

Hifadhi sehemu ya I kwa 4°C na Sehemu ya II kwa -20°C.

Foregene Protease Plus II inapaswa kuhifadhiwa kwa 4°C, isigandishwe kwa -20°C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman huhifadhiwa kwa -20°C, au kwa 4°C kwa matumizi ya muda mfupi ikiwa inatumiwa mara kwa mara (ndani ya siku 10).

Maelezo ya sehemu ya kit

Buffer CL: Hutoa mazingira yanayohitajika kwa athari za uchanganuzi wa seli.

Buffer ST: Hukomesha dutu amilifu katika lilisati ili kuepuka athari kwa RT inayofuata.

Kifutio cha DNA: Kiondoa DNA, athari ya kuondoa jenomu kwenye majaribio yaliyofuata.

5× Direct RT Mix: Ina mshikamano wa juu wa RNA Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, vidhibiti, viboreshaji, viboreshaji, na viasili vya unukuzi vya kinyume kwa upangaji bora (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Katika muktadha wa lysis buffer, seli hupangwa ili kutoa asidi nucleic.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Kitendanishi hiki kina Moto D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, bafa ya majibu, kiboreshaji cha PCR, na kidhibiti.

20× ROX Reference Dye: Kwa ujumla hutumika kwenye zana za ukuzaji za Muda Halisi za PCR za ABI, Stratagene na kampuni zingine, hutumika kurekebisha tofauti kati ya mirija ya PCR na mirija inayosababishwa na makosa ya kipimo cha PCR.Mkusanyiko wa Rangi ya Marejeleo ya 20× ROX inayohitajika kwa zana tofauti ni tofauti, na mtumiaji anaweza kuiongeza kulingana na mkusanyiko uliopendekezwa wa chombo.

RNase-Free ddH₂O: Maji safi safi yasiyo na RNase kwa athari za hatua mbili za RT-qPCR.

Tahadhari:(Hakikisha unasoma tahadhari kwa uangalifu kabla ya kutumia kit)

Zingatia njia ya uendeshaji ya jaribio ili kuzuia uchafuzi wa mtambuka kati ya sampuli.

Zingatia usafi wa mazingira ya majaribio na vyombo ili kuepuka uchafuzi wa RNase na uharibifu wa RNA.

Chukua sampuli za seli mpya au zilizohifadhiwa vizuri na usiwahi kutumia sampuli za seli zilizogandishwa mara kwa mara.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman inapaswa kuepuka kugandisha mara kwa mara, vinginevyo itaathiri unukuzi wa kinyume na ufanisi wa PCR.

Prepamgaokablaoperesheni

Hakikisha kusoma maagizo kwa uangalifu kabla ya kutumia kit hiki.Kifaa cha Cell Direct RT-qPCR ni rahisi, rahisi, na kwa haraka kufanya kazi, na maagizo hutoa taarifa kamili kuhusu kit nzima na jinsi ya kukitumia kwa usahihi.Tafadhali tayarisha vifaa na vifaa vya majaribio vinavyohitajika kabla ya matumizi.

Vifaa vya majaribio na vifaa

◆ Seli za utamaduni.

◆ 1.5 ml au 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-Free ncha, 0.2 ml tasa qPCR tube.

◆ qPCR mashine, pipette, tabletop centrifuge (≥13,400×g) (kulingana na mahitaji ya majaribio), nk.

Usalama

◆ Bidhaa hii ni kwa madhumuni ya utafiti wa kisayansi pekee, tafadhali usiitumie kwa madhumuni ya dawa, kliniki, chakula na vipodozi.

◆ Unapotumia kemikali, vaa nguo zinazofaa za maabara, glavu, miwani ya kinga, n.k.

Operesheniviongozi

Mifumo ya seli za Lysis, mifumo ya RT, na vifurushi vya nyongeza vya majibu ya qPCR vinaweza kununuliwa kando, kwa maelezo katika Kiambatisho cha 1 (UKURASA WA 13).

Mwongozo wa uendeshaji

A: Sampuli ya kutolewa kwa RNA

1.Seli zilitengenezwa mapema: Osha bamba la uundaji seli na PBS baridi, kisha panga seli (10-10).⁶), 10⁶ kuliko kiasi cha seli, inapendekezwa Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) au Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) kwa ajili ya uchimbaji na utakaso wa RNA.

1.1.Seli zinazoshikamana (24- sahani ya kisima kama mfano)

1.1.1.Amua idadi ya seli kwenye kila kisima, tambua kuwa idadi ya seli ni 1 × 10⁵, na kutumia pipette kuondoa utamaduni kutoka sahani ya utamaduni.

1.1.2.Ongeza 200 μl ya 1 × PBS iliyopozwa kabla kwa kila kisima.Usipige bomba mara kwa mara na uondoe PBS kutoka kwenye visima.Tilt sahani na kuondoa PBS nyingi iwezekanavyo.Nenda kwa hatua ya 2.

1.1.3.Sahani tofauti ya utamaduni wa seli au jedwali la nambari ya kumbukumbu 1-1 katika sahani ya utamaduni wa seli iliongezwa ikiwa imepozwa kabla ya 1 × PBS kwa kuosha seli.

Jedwali 1-1: Kipimo cha PBS kwa idadi tofauti ya seli

Kumbuka:Ili kuhakikisha seli mfungamano thabiti,idadi kubwa ya kupoteza kiini kuepukwa wakati wa kuosha.

1.2.Seli za kusimamishwa au seli zinazofuata zilizokuzwa katika sahani zisizo na vinyweleo

1.2.1.Seli zinazoshikamana zilizokuzwa katika sahani zisizo za visima vingi (seli za kusimamishwa huanza kutoka hatua inayofuata 1.2.2), kukusanya na kutenganisha seli kulingana na njia ya kawaida ya kukusanya seli, na kuziweka kwenye sahani ya utamaduni au tube ya centrifuge;ikiwa trypsinization itatumika, inahitaji uwekaji katikati ili kukusanya seli na kuondoa trypsin iliyobaki, iliongeza seli zilizorejeshwa za PBS kwenye seli mahususi ili kutawanya seli.

1.2.2.Baada ya idadi ya seli kuhesabiwa, seli alinukuu 1×10⁵ moja hadi zilizopo za centrifuge, kukusanya seli kwa centrifugation saa 1000 × g kwa 10 min.

1.2.3.Ongeza 200 μl PBS kwenye bomba la centrifuge, usipige bomba mara kwa mara, na utamani PBS moja kwa moja.endelea kwa hatua ya 2. (Ikiwa ni vigumu kunyesha na seli zilisimamishwa tena, inaweza kufanywa 1000×g centrifuged dakika 10 baada ya kutupa nguvu kuu, pellet ya seli inaendelea hadi hatua ya 2)

2.Uchanganuzi wa seli: Ondoa Buffer CL, joto lake likiwa sawa na joto la kawaida, Kifutio cha DNA na Foregene Protease Plus II, kulingana na jedwali lifuatalo la mfumo wa lysis ulioandaliwa 1-2: (Suluhisho la Lysis liko tayari kutumika).

Jedwali 1-2: cleavage utayarishaji wa mfumo (Kumbuka: katika utayarishaji kwenye barafu)

3.( 24 -bahani ya kisima kama mfano) Pipette 200 μl ya chembe chembe chenga mchanganyiko katika kila kisima, Pigia mara kwa mara mara 5-10, Ingiza kwenye joto la kawaida (20-25 ℃) kwa dakika 5 .

Kumbuka:Ili kuzuia uundaji wa Bubbles, tafadhali wakati kipimo cha pipette kilirekebishwa hadi 200μl au chini.Seli zinaweza kuonekana kuwa na mawingu baada ya lysis, ambayo ni ya kawaida.

4.(24 –kibao cha kisima kama mfano) huongezwa kwenye kimiminika 20 μl Buffer ST (mifumo tofauti ya lysis Buffer ST iliyoongezwa kwa kiasi kilichoonyeshwa kwenye Jedwali 1-3), upigaji bomba unaorudiwa mara 5-10, kwenye joto la kawaida(20-25 ℃) ziliwekwa ndani kwa dakika 2.

Kumbuka:Ncha ya pipette inatupwa chini ya uso, kuhakikisha kwamba lysate iliongezwa,ili kuzuia uundaji wa Bubbles, tafadhali wakati kipimo cha pipette kilirekebishwa hadi 200μl au chini.

Jedwali 1-3:Ongeza Buffer ST

5.Lysate inatumika kwa majaribio yanayofuata ya RT-qPCR.Ikiwa majaribio yanayofuata hayawezi kufanywa kwa wakati, tafadhali iweke kwenye barafu kwa si zaidi ya saa 2, na uhifadhi kwa -20℃ au -80 ℃ (sio zaidi ya miezi mitatu).

B: Maandalizi ya mfumo wa RT

1.Toa 5 × Direct RT Mix na kuiweka kwenye umwagaji wa barafu, iache iweze kuyeyuka kwa kawaida, na uchanganya kwa upole kwa matumizi ya baadaye;toa RNase-Free ddH2O na kuyeyusha na kuiweka kwenye bafu ya barafu kwa matumizi ya baadaye.Andaa mfumo wa majibu kwenye barafu kulingana na Jedwali 2-1 hapa chini.

Jedwali 2-1: Maandalizi ya mfumo wa mmenyuko wa RT

2.Baada ya kukamilika kwa uundaji wa mfumo, changanya kwa upole na centrifuged kwa muda mfupi katika jedwali lifuatalo 2 -2 hali ya mmenyuko wa RT.

Jedwali la 2-2: Mpangilio wa hali ya Majibu ya RT

3.Baada ya kukamilika kwa majibu, bidhaa ya majibu iliwekwa moja kwa moja kwenye barafu kwa qPCR, tafadhali weka uhifadhi wa muda mrefu -20℃ au -80 ℃.

Kumbuka: Kutokana na matumizi ya kiolezo ambacho hakijasafishwa, mvua nyeupe inaweza kuonekana katika bidhaa ya unukuzi wa kinyume.Hili ni jambo la kawaida.Centrifuge supernatant mara moja kwa majaribio yanayofuata.

Suluhisho la mmenyuko la RT linaongezwa kwa hatua inayofuata ya mifumo ya majibu ya PCR ya Muda Halisi, inashauriwa kuongeza kiasi cha kuanzia 10-30% ya mfumo wa majibu.

C: Maandalizi ya mfumo wa majibu ya qPCR

1.Kiasi kinachofaa cha B kilichotayarishwa katika kiolezo cha cDNA cha hatua kulingana na jedwali lifuatalo 3-1 ili kuandaa mfumo wa majibu.

Kumbuka: Kiasi cha kiolezo cha cDNA kinachangia 10-30% ya mfumo wa qPCR.Kwa mfano, katika mfumo wa 20μl qPCR, ongeza 2-6 μl ya bafa ya lysis, lakini si zaidi ya 6 μl.

2.Uboreshaji wa hali nzuri za qPCR (joto la annealing, n.k.) kwa mmenyuko wa qPCR (Masharti ya majibu yaliyotolewa kwenye Jedwali 3-2).

Kumbuka: Jaribu kutumia hali iliyoboreshwa kwa miitikio ya qPCR ili kupata matokeo bora.

Jedwali 3-1: Maandalizi ya mfumo wa majibu ya PCR

1*: Mkusanyiko wa primer unaweza kurekebishwa katika anuwai ya 50-900 nM wakati utendakazi wa majibu ya primer ni duni.

Kumbuka: Mfumo wa qPCR unaweza kurekebishwa kulingana na mahitaji ya majaribio na modeli ya kizunguzungu cha fluorescence.Kwa qPCR katika 50μl mfumo, rekebisha kipimo cha reagent sawia kulingana na 20μl mfumo.

2*: Chagua mkusanyiko ufaao wa mwisho wa ROX Reference Dye kulingana na fluorescence quantitative thermal cycler.Viwango vinavyofaa zaidi vya Rangi ya Marejeleo ya ROX kwa baisikeli za kiasi cha fluorescence zinaonyeshwa kwenye jedwali hapa chini:

Jedwali 3-2: Masharti ya majibu ya qPCR yametolewa

Kumbuka: Ili kupata athari bora zaidi ya qPCR, gradient PCR inaweza kutumika kuboresha hali ya majibu kwa violezo tofauti na vianzio tofauti.Masharti ya athari ya PCR hutofautiana kulingana na kichanganuzi cha umeme, kiolezo, kitangulizi, n.k. Katika utendakazi mahususi, hali bora zaidi za mwitikio zinahitaji kutengenezwa kulingana na hali mahususi za kizunguzungu cha kiasi cha joto cha umeme, aina ya kiolezo, ukubwa wa kipande cha riba, mlolongo wa msingi wa kipande kilichoimarishwa na muda wa ziada wa GC, urefu wa halijoto, na halijoto ya kawaida, na maudhui ya joto ya ziada.

Kanuni za muundo wa primer ya Muda Halisi ya PCR

Sambaza Kitangulizi na Kitangulizi cha Nyuma

Kwa PCR ya Wakati Halisi, muundo wa primer ni muhimu sana.Viunzilishi vinahusiana na umaalum na ufanisi wa ukuzaji wa PCR, na vinaweza kuundwa kwa kuzingatia kanuni zifuatazo:

◆ Urefu wa primer: 18-30bp.

◆ Maudhui ya GC: 40-60%.

◆ Thamani ya Tm: Programu ya muundo wa Primer, kama vile Primer 5, inaweza kutoa thamani ya Tm ya kitangulizi.Thamani za Tm za vianzilishi vya juu na chini zinapaswa kuwa karibu iwezekanavyo.Fomula ya hesabu ya Tm pia inaweza kutumika: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Wakati wa kutekeleza PCR, halijoto iliyo chini ya thamani ya primer Tm ya 5 °C kwa ujumla huchaguliwa kama halijoto ya kuchuja (ongezeko linalolingana la halijoto ya kuchubua kunaweza kuongeza umaalum wa mmenyuko wa PCR).

◆ Primers na bidhaa za PCR:

◆ Urefu wa bidhaa za ukuzaji wa kitangulizi cha PCR bora ni 100-150bp.

◆ Mipangilio ya utangulizi katika eneo la sekondari la muundo wa kiolezo inapaswa kuepukwa iwezekanavyo.

◆ Epuka uundaji wa besi 2 au zaidi zinazosaidiana kati ya ncha 3′ za vianzio vya juu na vya chini vya mkondo.

◆ Msingi wa msingi wa 3′ hauwezi kuwepo na G au C 3 za ziada mfululizo.

◆ Watangulizi wenyewe hawawezi kuwa na miundo ya ziada, vinginevyo muundo wa nywele utaundwa, unaoathiri amplification ya PCR.

◆ ATCG inapaswa kusambazwa kwa usawa iwezekanavyo katika mfuatano wa kwanza, na msingi wa 3′ unapaswa kuepukwa kama T.

Nyongeza1:Cmoja kwa mojaRT-qPCR Sehemu ya vifaat nyongeza pakiti

1.Kiini Lysis Solution