Inajulikana kuwa katika itikadi kuu, RNA ndiye mpatanishi wa maandishi kati ya DNA na usemi wa protini.Ikilinganishwa na ugunduzi wa DNA, ugunduzi wa RNA unaweza kuonyesha kwa uwazi zaidi usemi wa jeni katika viumbe.Majaribio yanayohusisha RNA ni pamoja na: qRT-PCR, RNA-Seq, na ugunduzi wa jeni za muunganisho, n.k. Kulingana na sifa za RNA yenyewe (pete ya sukari ya RNA ina kundi moja zaidi la hidroksili isiyolipishwa kuliko pete ya sukari ya DNA), ikiunganishwa na idadi kubwa ya RNases katika mazingira, RNA haina msimamo zaidi na ni rahisi kuharibiwa kuliko DNA.Taka ndani, takataka nje, ikiwa ubora wa RNA si mzuri, basi matokeo ya majaribio lazima yawe ya kuridhisha, yanaonyeshwa haswa kama data isiyo sahihi au kurudiwa duni.Kwa hiyo, tahadhari zaidi inapaswa kulipwa kwa usindikaji wa RNA, na kiungo cha udhibiti wa ubora pia ni muhimu zaidi ili kuhakikisha usahihi na usahihi wa data ya majaribio inayofuata.

Kwa udhibiti wa ubora wa RNA, kwa ujumla kuna njia zifuatazo zinazotumiwa kawaida:

• Spectrophotometry
• electrophoresis ya gel ya agarose
• Agilent Bioanalyzer
• PCR ya muda halisi ya umeme
• Njia ya rangi ya fluorescent ya Qubit

01 Spectrophotometry

RNA imeunganisha vifungo viwili na ina kilele cha kunyonya kwa urefu wa wimbi la 260nm.Kulingana na sheria ya Lambert-Beer, tunaweza kuhesabu ukolezi wa RNA kutoka kilele cha kunyonya kwa 260nm.Kwa kuongeza, tunaweza pia kuhesabu usafi wa RNA kulingana na uwiano wa vilele vya 260nm, 280nm na 230nm.280nm na 230nm ni vilele vya kunyonya vya protini na molekuli ndogo, mtawaliwa.Uwiano wa A260/A280 na A260/A230 wa usafi wa RNA uliohitimu unapaswa kuwa mkubwa kuliko 2. Ikiwa ni chini ya 2, inamaanisha kuwa kuna uchafuzi wa protini au molekuli ndogo katika sampuli ya RNA na inahitaji kusafishwa tena.Vyanzo vya uchafuzi vitaathiri majaribio ya chini, kama vile kuzuia ufanisi wa ukuzaji wa athari za PCR, na kusababisha matokeo ya kiasi yasiyo sahihi.Usafi wa RNA una ushawishi mkubwa kwa matokeo yanayofuata, kwa hivyo spectrophotometry kwa ujumla ni kiungo cha kudhibiti ubora katika hatua ya kwanza ya majaribio ya asidi ya nukleiki.

Kielelezo 1. Spectrum ya Kawaida ya RNA/DNA ya Kunyonya

02 Electrophoresis ya gel ya Agarose

Mbali na usafi, uadilifu wa RNA pia ni moja ya viashiria muhimu vya kuhukumu ubora wa RNA.Uharibifu wa RNA utasababisha idadi kubwa ya vipande vifupi katika sampuli, hivyo idadi ya vipande vya RNA vinavyoweza kugunduliwa kwa ufanisi na kufunikwa na mlolongo wa kumbukumbu itapunguzwa.Uadilifu wa RNA unaweza kuchunguzwa na electrophoresis ya jumla ya RNA kwenye gel ya agarose ya 1%.Njia hii inaweza kusanidi jeli mwenyewe, au kutumia Mfumo wa E-Gel™ uliotengenezwa tayari kwa majaribio ya uadilifu.Zaidi ya 80% ya jumla ya RNA ni ribosomal RNA, ambayo nyingi ni 28S na 18S rRNA (katika mifumo ya mamalia).RNA ya ubora mzuri itaonyesha baa mbili za wazi wazi, ambazo ni 28S na 18S za mkali, kwa mtiririko huo, kwa 5 Kb na 2 Kb, na uwiano utakuwa karibu na 2: 1.Ikiwa iko katika hali ya kuenea, inamaanisha kuwa sampuli ya RNA inaweza kuwa imeharibiwa, na inashauriwa kutumia njia iliyoelezwa baadaye ili kupima zaidi ubora wa RNA.

Kielelezo 2. Ulinganisho wa iliyoharibika (laini ya 2) na RNA isiyoharibika (njia ya 3) kwenye electrophoresis ya gel ya agarose.

03 Agilent Bioanalyzer

Mbali na njia ya electrophoresis ya gel ya agarose iliyoelezwa hapo juu, ambayo inaweza kutusaidia kutambua uadilifu wa RNA kwa urahisi na kwa haraka, tunaweza pia kutumia Agilent bioanalyzer ili kuamua uadilifu wa RNA.Inatumia mchanganyiko wa microfluidics, electrophoresis ya kapilari, na fluorescence kutathmini mkusanyiko na uadilifu wa RNA.Kwa kutumia algoriti iliyojumuishwa ili kuchanganua wasifu wa sampuli ya RNA, Agilent bioanalyzer inaweza kukokotoa thamani ya marejeleo ya uadilifu ya RNA, Nambari ya Uadilifu ya RNA (hapa inajulikana kama RIN) [1].Kadiri thamani ya RIN inavyokuwa kubwa, ndivyo uadilifu wa RNA unavyoongezeka (1 ni duni sana, 10 ndio kamili zaidi).Baadhi ya majaribio yanayohusisha RNA yanapendekeza kutumia RIN kama kigezo cha kutathmini ubora.Kwa kuchukua majaribio ya upangaji wa matokeo ya juu (hapa yanajulikana kama NGS) kama mfano, miongozo ya Repertoire ya Kinga ya Kinga ya Binadamu ya Oncomine™, ambayo hutumika kutambua vipokezi vya antijeni vya seli B na T katika mfululizo wa paneli za Oncomine wa Thermo Fisher, unapendekeza kuwa sampuli zilizo na thamani za RIN zaidi ya 4, Visomo na miiko yenye ufanisi zaidi inaweza kupimwa (3).Kuna safu tofauti zinazopendekezwa kwa paneli tofauti, na mara nyingi RIN ya juu inaweza kuleta data bora zaidi.

Kielelezo cha 3, katika majaribio ya Repertoire ya Kinga ya Binadamu ya Oncomine™, sampuli zilizo na RIN kubwa kuliko 4 zinaweza kugundua usomaji bora zaidi na kloni za seli za T.【2】

Walakini, thamani ya RIN pia ina mapungufu.Ingawa RIN ina uwiano wa juu na ubora wa data ya majaribio ya NGS, haifai kwa sampuli za FFPE.Sampuli za FFPE zimetibiwa kwa kemikali kwa muda mrefu, na RNA iliyotolewa kwa ujumla ina thamani ya chini ya RIN.Walakini, hii haimaanishi kuwa data inayofaa ya jaribio lazima isiridhishe.Ili kutathmini kwa usahihi ubora wa sampuli za FFPE, tunahitaji kutumia vipimo vingine kando na RIN.Kando na RIN, Agilent bioanalyzer pia inaweza kukokotoa thamani ya DV200 kama kigezo cha tathmini ya ubora wa RNA.DV200 ni kigezo kinachokokotoa uwiano wa vipande vikubwa kuliko bp 200 katika sampuli ya RNA.DV200 ni kiashirio bora cha ubora wa sampuli ya FFPE kuliko RIN.Kwa RNA iliyotolewa na FFPE, ina uwiano wa juu sana na idadi ya jeni inayoweza kutambuliwa kwa ufanisi na utofauti wa jeni [3].Ingawa DV200 inaweza kufidia mapungufu katika utambuzi wa ubora wa FFPE, Agilent bioanalyzer bado haiwezi kuchanganua kwa kina matatizo ya ubora katika sampuli za RNA, ikijumuisha iwapo kuna vizuizi kwenye sampuli.Vizuizi vyenyewe vinaweza kuathiri ufanisi wa ukuzaji wa majaribio ya chini na kupunguza kiwango cha data muhimu.Ili kujua kama kuna kizuizi katika sampuli, tunaweza kutumia mbinu ya upimaji wa wakati halisi ya umeme ya PCR iliyofafanuliwa baadaye.

04 PCR ya muda halisi ya umeme

Mbinu ya kiasi cha umeme ya wakati halisi ya PCR haiwezi tu kugundua vizuizi kwenye sampuli, lakini pia kuonyesha kwa usahihi ubora wa RNA katika sampuli ya FFPE.Ikilinganishwa na vichanganuzi vya kibayolojia vya Agilent, zana za upimaji wa wakati halisi wa fluorescence ni maarufu zaidi katika maabara kuu za kibaolojia kutokana na matumizi yake mapana.Ili kupima ubora wa sampuli za RNA, tunahitaji tu kununua au kuandaa vichunguzi vya kwanza vya jeni za marejeleo ya ndani, kama vile GUSB (Paka no. Hs00939627).Kwa kutumia seti hii ya vianzio, uchunguzi na viwango (jumla ya RNA ya mkusanyiko unaojulikana) kufanya majaribio ya kiasi kamili, ukolezi bora wa kipande cha RNA unaweza kukokotwa kama kiwango cha tathmini ya ubora wa RNA (Kipimo Kitendaji cha RNA (FRQ) kwa ufupi).Katika jaribio la NGS, tuligundua kuwa FRQ ya sampuli za RNA ina uwiano wa juu sana na ujazo wa data unaofaa.Kwa sampuli zote kubwa zaidi ya 0.2ng/uL FRQ, angalau 70% ya usomaji unaweza kufunika mfuatano wa marejeleo kwa ufanisi (Mchoro 4).

Kielelezo cha 4, thamani ya FRQ iliyogunduliwa na mbinu ya upimaji wa fluorescence ina uwiano wa juu sana (R2>0.9) na data bora iliyopatikana katika jaribio la NGS.Mstari mwekundu ni thamani ya FRQ sawa na 0.2 ng/uL (logi10 = -0.7).【4】

Mbali na kutumika kwa sampuli za FFPE, mbinu ya muda halisi ya upimaji wa PCR inaweza pia kufuatilia kwa ufanisi vizuizi katika sampuli.Tunaweza kuongeza sampuli ili itambuliwe kwenye mfumo wa majibu kwa kutumia Kidhibiti Chanya cha Ndani (IPC) na Uchambuzi wake, kisha tufanye ukadiriaji wa umeme ili kupata thamani ya Ct.Ikiwa thamani ya Ct iko nyuma ya thamani ya Ct katika mmenyuko usio na sampuli, inaonyesha kuwa kizuizi kipo kwenye sampuli na huzuia ufanisi wa ukuzaji katika majibu.

05 Mbinu ya rangi ya Qubit ya fluorescent

Fluorometa ya Qubit ndicho kifaa kidogo kinachotumiwa zaidi kwa mkusanyiko wa asidi ya nukleiki na utambuzi wa usafi, ambacho ni rahisi kufanya kazi na kinapatikana katika karibu kila maabara ya baiolojia ya molekuli.Hukokotoa kwa usahihi mkusanyiko wa asidi nucleic kwa kugundua na rangi ya umeme inayofunga asidi ya nukleiki (kitendanishi cha kugundua Qubit).Qubit ina usikivu wa hali ya juu na umaalum, na inaweza kukadiria kwa usahihi RNA hadi mkusanyiko wa pg/µL.Mbali na uwezo unaojulikana wa kukadiria kwa usahihi ukolezi wa asidi ya nukleiki, mtindo mpya wa Thermo Fisher, Qubit 4.0, unaweza pia kutambua uadilifu wa RNA.Mfumo wa kugundua RNA wa Qubit 4.0′s (RNA IQ Assay) hutambua uadilifu wa RNA kwa kugundua wakati huo huo rangi mbili mahususi za fluorescent.Rangi hizi mbili za fluorescent zinaweza kushikamana na vipande vikubwa na vipande vidogo vya RNA, kwa mtiririko huo.Rangi hizi mbili za fluorescent zinaonyesha uwiano wa vipande vikubwa vya RNA katika sampuli, na kutokana na hili thamani ya IQ (Uadilifu na Ubora) inayowakilisha ubora wa RNA inaweza kuhesabiwa.Thamani ya IQ inatumika kwa sampuli za FFPE na zisizo za FFPE, na ina ushawishi mkubwa kwenye ubora wa mfuatano unaofuata.Kwa kuchukua majaribio ya NGS kama mfano, katika majaribio ya majaribio ya RNA-Seq yaliyofanywa kwenye jukwaa la Ion torrent™, sampuli nyingi zenye thamani za IQ zaidi ya 4 zilikuwa na angalau 50% ya usomaji bora (Mchoro 5).Ikilinganishwa na mbinu za ugunduzi zilizotajwa hapo juu, Qubit IQ Assay si rahisi tu kufanya kazi na inachukua muda mfupi (ndani ya dakika tano), lakini pia ina uwiano mkubwa kati ya kigezo cha thamani ya IQ kilichopimwa na ubora wa data wa majaribio ya chini.

Kielelezo cha 5, kuna uwiano mkubwa kati ya thamani ya Qubit RNA IQ na usomaji wa ramani wa RNA-Seq.【5】

Kupitia utangulizi ulio hapo juu, ninaamini kwamba kila mtu ana uelewa wa kutosha wa mbinu tofauti za udhibiti wa ubora wa RNA.Katika mazoezi, unaweza kuchaguanjia inayolingana kulingana na aina ya sampuli na vyombo vilivyopo.Ni kwa kudhibiti ubora wa RNA tu ndipo tunaweza kuepuka kutofaulu kwa majaribio yanayofuata yanayosababishwa na ubora duni wa sampuli, hivyo kuokoa muda wa thamani, nishati na gharama.

Bidhaa za marejeleo:

Seti ya Kutenga ya RNA ya Wanyama

Seli Jumla ya Seli ya Kutenga ya RNA

marejeleo

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: nambari ya uadilifu ya RNA ya kukabidhi thamani za uadilifu kwa vipimo vya RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Mwongozo wa Mtumiaji wa Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Vipimo Vilivyoimarishwa vya Ubora vya Kutathmini RNA Inayotokana na Sampuli za Tishu Zilizopachikwa kwenye Jalada Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, Sayansi ya Sumu, Juzuu 3720, 1720, Agosti 39, Issue 39, Issue 39https://doi.org/10.1093/toxsci/