Jaribio la RT-qPCR linajumuisha uchimbaji wa RNA na tathmini ya ubora, unukuzi wa kinyume na qPCR hatua tatu, kila hatua ina tahadhari nyingi, tutakuletea kwa undani hapa chini.

Ⅰ.Tathmini ya ubora wa RNA

Katika jaribio la RT-qPCR, baada ya kukamilika kwa uchimbaji wa RNA, ubora wa RNA unahitaji kutathminiwa, na jaribio la ufuatiliaji linaweza tu kufanywa baada ya kuhitimu.Mbinu za tathmini ni pamoja na spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 uchanganuzi, kati ya ambayo spectrophotometer inayotumiwa zaidi na ugunduzi wa njia ya electrophoresis ya gel ya agarose.Ikumbukwe kwamba mbinu hizi mbili zinahitajika kutumika pamoja ili kukamilisha utambuzi na uchambuzi wa ukolezi wa RNA, usafi na uadilifu, ili kuhakikisha ubora wa RNA.

Seti ya Kutengwa kwa RNA inayohusiana: 

Seli Jumla ya Seli ya Kutenga ya RNA

Jumla ya RNA iliyosafishwa sana na ya ubora wa juu inaweza kupatikana kutoka kwa seli mbalimbali zilizokuzwa kwa dakika 11.

Seti ya Kutenga ya RNA ya Wanyama

Haraka na kwa ufanisi toa jumla ya RNA yenye ubora wa juu na wa hali ya juu kutoka kwa tishu mbalimbali za wanyama.

Spectrophotometer:

Kipima spectrophotometer hutumiwa hasa kuamua ukolezi na usafi wa RNA, lakini haiwezi kutambua uadilifu wa RNA na mabaki ya genomic.Miongoni mwao, A260/280 na A260/230 ni vigezo muhimu vya kugundua usafi wa RNA, na usafi wa RNA unaweza kugunduliwa kulingana na mabadiliko ya maadili yao:

1. 1.9< A260/280< 2.1, ikionyesha kwamba usafi wa RNA ni mzuri;A260/280<1.9, ikionyesha kwamba kunaweza kuwa na mabaki ya protini katika RNA;A260/280>2.1, ikionyesha uwezekano wa uharibifu wa sehemu ya RNA, ambayo inaweza kuthibitishwa zaidi na electrophoresis ya gel ya agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, ikionyesha kwamba usafi wa RNA ni mzuri;A260/230< 2.0, ikionyesha kuwa kunaweza kuwa na mabaki ya vitendanishi vya kikaboni katika RNA, kama vile fenoli, ethanoli au sukari.

Electrophoresis ya gel ya Agarose:

Kipimo cha electrophoresis ya jeli ya Agarose kinaweza kuchanganua uadilifu wa RNA, jenomu na mabaki ya protini, lakini haiwezi kutathmini kwa usahihi mkusanyiko wa RNA au kugundua mabaki ya vitendanishi vya kikaboni.Chukua violezo vya RNA ya yukariyoti kwa mfano:

1. RNA iliwekwa chini ya electrophoresis ya gel ya agarose.Ikiwa kulikuwa na bendi tatu pekee za 28sRNA, 18sRNA na 5.8sRNA kwenye ramani ya gel, inaonyesha kuwa RNA iliyotolewa ni sawa.Ikiwa kuna jambo la kuvuta, linaonyesha uharibifu wa sehemu ya RNA.

2. Ikiwa kuna bendi moja mkali kati ya shimo la gundi na bendi ya 28sRNA, kunaweza kuwa na mabaki ya DNA ya genomic.

3. Ikiwa bendi zinaonekana kwenye shimo la gundi, inaonyesha kwamba kunaweza kuwa na mabaki ya protini na vitu vingine vya macromolecular.

Ⅱ. Unukuzi wa kinyume

Baada ya uchimbaji wa RNA kukamilika, inahitaji kubadilishwa kuwa cDNA kwa majaribio yanayofuata, kwa hivyo hatua ya kutengua ni muhimu.Unukuzi wa kinyume utaanzishwa kutoka kwa uteuzi wa reverse transcriptase na primer:

Badilisha uteuzi wa nakala:

Nakala za kawaida za kinyume ni pamoja na AMV RTase na MMLV RTase.RNase H ya AMV RTase ina shughuli kali, urefu mfupi wa usanisi, kiasi cha chini cha usanisi na uthabiti mzuri wa mafuta (42 ~ 55℃).Shughuli ya RNase H ya MMLV RTase ni dhaifu, urefu wa awali ni mrefu, kiasi cha awali ni cha juu, na utulivu wa joto ni duni (37 ~ 42 ℃).

Kwa sababu kimeng'enya cha RNase H kina kazi ya kuharibu kiolezo cha RNA, MMLV iliyo na shughuli dhaifu ya RNase H inapaswa kuchaguliwa kwa upendeleo wakati wa unukuzi wa kinyume, na baada ya uhandisi wa jenetiki wa baadaye, uthabiti wa joto wa MMLV umefikia kiwango cha ubora.Kuchukua ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV kwa unukuzi wa kinyume) kama mfano, ni nakala mpya ya reverse iliyoonyeshwa katika bakteria iliyobuniwa ya E. koli kwa kutumia teknolojia ya ujumuishaji upya wa kijeni.Ni polimasi ya DNA inayojumuisha tena ambayo huunganisha uzi wa DNA kutoka kwa RNA yenye nyuzi moja, DNA, au RNA:mseto wa DNA.Haina shughuli ya RNase H, uthabiti dhabiti, mshikamano thabiti wa RNA, na ugunduzi wa hali ya juu.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV kwa unukuzi wa kinyume)

Uchaguzi wa primer:

Kwa ujumla viasili vya RT viko katika kategoria tatu: oligo dT, vianzilishi nasibu, na vianzilishi maalum vya jeni.Chagua vianzio vinavyofaa kwa matumizi kulingana na mahitaji tofauti ya majaribio.

1. Ikiwa kiolezo ni cha asili ya yukariyoti na cDNA iliyochelewa inatumiwa kwa ukuzaji wa PCR wa kawaida, Oligo (dT) inapendekezwa;Ikiwa jaribio linalofuata litatumika kwa qPCR pekee, Oligo (dT) inapendekezwa kuchanganywa na viasili nasibu ili kuboresha ufanisi wa unukuzi wa kinyume.

2. Iwapo kiolezo kimetoka kwa prokariyoti, Viingilio Nasibu au viasili maalum vya jeni vinapaswa kuchaguliwa kwa unukuzi wa kinyume.

Ⅲ.qPCR

Ukadiriaji wa Fluorescence unafafanuliwa hasa kutokana na uteuzi wa mbinu za upimaji, kanuni za muundo wa msingi, uteuzi wa ROX, usanidi wa mfumo wa majibu na mipangilio ya hali ya majibu, nk.

Uchaguzi wa mbinu za kiasi:

Mbinu za upimaji zimegawanywa katika mbinu za kiasi cha jamaa na mbinu za kiasi kamili.Ukadiriaji jamaa unaweza kutumika kugundua athari za mbinu fulani za matibabu kwenye usemi wa jeni, kugundua tofauti ya usemi wa jeni kwa nyakati tofauti na kulinganisha tofauti ya usemi wa jeni katika tishu tofauti.Kuhesabu kamili kunaweza kuchunguza kiasi cha asidi ya nucleic katika virusi na kadhalika.Wakati wa kufanya majaribio, lazima tuchague mbinu zinazofaa za upimaji kulingana na majaribio yetu wenyewe.

Kanuni za msingi za kubuni:

Muundo wa primer kwa qPCR unahusiana moja kwa moja na ufanisi wa ukuzaji na umaalumu wa bidhaa.Kwa hiyo, kwa usahihi kubuni primers nzuri ni hatua ya kwanza ya mafanikio ya qPCR.Katika muundo wa primer, kanuni zifuatazo zinapaswa kuzingatiwa wakati wa kufikia kanuni ya muundo wa kawaida wa primer:

1. Urefu wa kipande kinacholengwa hudhibitiwa kati ya 100 na 300 bp;

2. Muundo wa njia mbalimbali ili kuepuka ushawishi wa DNA ya genomic;

3. Vitambulisho vilivyoundwa vinahitaji kujaribiwa kwa ufanisi wa ukuzaji, na tu wakati ufanisi wa ukuzaji unafikia kiwango (90-110%) ndipo unaweza kutumika kwa majaribio ya kiasi;

4. Mkusanyiko wa primer kawaida huboreshwa kati ya 0.1uM na 1.0uM.

Uteuzi waROX:

Katika mchakato wa mmenyuko wa kiasi, ROX inaweza kurekebisha tofauti ya njia ya macho, hitilafu ya bomba au tofauti ya kiasi inayosababishwa na uvukizi na condensation sare, kuboresha kurudiwa kwa matokeo.Hata hivyo, ni lazima ieleweke kwamba uteuzi wa ROX unahusiana na chombo.Ikiwa chombo cha qPCR kina kazi ya kurekebisha moja kwa moja tofauti kati ya mashimo, haihitaji kuongeza ROX;vinginevyo, inahitaji kuongeza marekebisho ya ROX.Washirika wadogo katika kununua reagents lazima kulingana na chombo kilichotumiwa kuchagua ROX sahihi, kuepuka makosa ya baadaye.

Maandalizi ya mfumo wa mmenyuko:

Kiasi cha majibu cha 20ul na 50ul kinapendekezwa.Mambo yafuatayo yanapaswa kuzingatiwa wakati mfumo unaundwa:

1. Mfumo wa majibu unahitaji kutayarishwa kwa uingizaji hewa katika benchi ya kazi iliyo safi kabisa, ddH mpya.₂O hutumiwa kwa kila jaribio;

2. Kila jaribio linahitaji kuandaa NTC ili kuthibitisha kama kuna uchafuzi wa mazingira katika mfumo, na kila jozi ya vianzio inahitaji kufanya NTC wakati wa kuandaa mfumo;

3. Ili kugundua ikiwa kuna mabaki ya gDNA katika kiolezo cha RNA, NRT inaweza kutayarishwa kwa kila sampuli ili kugunduliwa;

4. Wakati wa kuandaa mfumo, inashauriwa kufanya angalau marudio 3 ya kiufundi kwa sampuli moja;

5. Wakati kiolezo ni cDNA, inapendekezwa kupunguzwa mara 5-10 ili kupunguza athari ya kizuizi cha mfumo wa unukuzi wa kinyume kwenye jaribio la qPCR.Ni bora kuchunguza wingi wa template kwa gradient, ili thamani ya CT iko kati ya 20-30;

6. Kuamua idadi inayotakiwa ya athari, ongezeko la 5-10% kwa misingi ya idadi ya athari, na uhesabu idadi ya usanidi wa kiasi;

7, mfumo ni tayari kwa kutumia kanuni premix, kuchanganya baada ya centrifugation na kuhakikisha hakuna Bubbles;

8, iwezekanavyo kuchagua vifaa vya matumizi.

Seti ya RT-qPCR inayohusiana