RT-qPCR imetengenezwa kutoka kwa teknolojia ya kawaida ya PCR.Huongeza kemikali za umeme (dyes za fluorescent au probes za umeme) kwenye mfumo wa kawaida wa athari ya PCR, na hutambua mchakato wa upanuzi wa PCR kwa wakati halisi kulingana na njia zao tofauti za mwanga.Mabadiliko ya ishara ya fluorescent katika kati hutumiwa kuhesabu kiasi cha mabadiliko ya bidhaa katika kila mzunguko wa PCR.Hivi sasa, njia za kawaida ni njia ya rangi ya fluorescent na njia ya uchunguzi.

Njia ya rangi ya fluorescent:
Baadhi ya rangi za fluorescent, kama vile SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, n.k., hazitoi mwanga zenyewe, lakini hutoa umeme baada ya kushikamana na mkondo mdogo wa dsDNA.Kwa hiyo, mwanzoni mwa mmenyuko wa PCR, mashine haiwezi kuchunguza ishara ya fluorescent.Wakati mmenyuko unaendelea kwa annealing-extension (njia ya hatua mbili) au hatua ya upanuzi (njia ya hatua tatu), nyuzi mbili zinafunguliwa kwa wakati huu, na polymerase mpya ya DNA Wakati wa usanisi wa strand, molekuli za fluorescent huunganishwa katika dsDNA groove ndogo na hutoa fluorescence.Kadiri idadi ya mizunguko ya PCR inavyoongezeka, rangi zaidi na zaidi huchanganyika na dsDNA, na mawimbi ya umeme pia huimarishwa kila mara.Chukua SYBR Green Ⅰ kama mfano.
Mbinu ya uchunguzi:
Uchunguzi wa Taqman ndio uchunguzi unaotumika sana wa hidrolisisi.Kuna kikundi cha fluorescent kwenye 5′ mwisho wa probe, kwa kawaida FAM.Uchunguzi wenyewe ni mfuatano unaosaidia jeni lengwa.Kuna kikundi cha kuzima umeme kwenye mwisho wa 3′ wa fluorophore.Kwa mujibu wa kanuni ya uhamishaji wa nishati ya mwangwi wa umeme (Förster resonance energy transfer, FRET), wakati mwandishi wa kikundi cha fluorescent (molekuli ya fluorescent ya wafadhili) na kikundi cha fluorescent inayozima (molekuli ya umeme ya kupokea) Wakati wigo wa uchochezi unapoingiliana na umbali ni karibu sana (7-10nm huweza kushawishi molekuli ya wafadhili), wakati autofluorescence ni dhaifu.Kwa hiyo, mwanzoni mwa mmenyuko wa PCR, wakati probe ni bure na intact katika mfumo, kikundi cha fluorescent cha mwandishi hakitatoa fluorescence.Wakati wa annealing, primer na probe hufunga kwa template.Wakati wa hatua ya ugani, polimasi huendelea kuunganisha minyororo mipya.DNA polymerase ina shughuli ya 5'-3′ ya exonuclease.Inapofikia uchunguzi, polimerasi ya DNA itahamisha uchunguzi kutoka kwa kiolezo, kutenganisha kikundi cha ripota cha fluorescent kutoka kwa kikundi cha quencher fluorescent, na kutoa mawimbi ya umeme.Kwa kuwa kuna uhusiano wa moja kwa moja kati ya uchunguzi na template, njia ya uchunguzi ni bora kuliko njia ya rangi kwa suala la usahihi na unyeti wa mtihani.

Kielelezo cha 1 Kanuni ya qRT-PCR

Kubuni ya primer
Kanuni:

Primers inapaswa kuundwa katika eneo lililohifadhiwa la mfululizo wa asidi ya nucleic na kuwa na maalum.

Ni bora kutumia mlolongo wa cDNA, na mlolongo wa mRNA pia unakubalika.Ikiwa sivyo, tafuta muundo wa eneo la cd wa mlolongo wa DNA.
Urefu wa bidhaa ya upimaji wa umeme ni 80-150bp, ndefu zaidi ni 300bp, urefu wa primer kwa ujumla ni kati ya besi 17-25, na tofauti kati ya vianzio vya juu na vya chini vya mto haipaswi kuwa kubwa sana.

Maudhui ya G+C ni kati ya 40% na 60%, na 45-55% ndiyo bora zaidi.
Thamani ya TM ni kati ya digrii 58-62.
Jaribu kuepuka dimers za primer na self-dimers, (hazionekani zaidi ya jozi 4 za besi za ziada zinazofuatana) muundo wa pini ya nywele, ikiwa haiwezi kuepukika, fanya ΔG<4.5kJ/mol* Ikiwa huwezi kuhakikisha kuwa gDNA imeondolewa wakati wa unukuzi wa reverse Safi, ni bora kubuni primers ya intron, ATs modified, GG / condo inaweza kuepuka TG / 3 ′ mwisho na inaweza kuepuka TG / GC muundo endelevu (2-3) vianzio na visivyo
maalum Homolojia ya mfuatano ulioimarishwa kwa njia tofauti ni ikiwezekana kuwa chini ya 70% au ina homolojia 8 za msingi.
Hifadhidata:
Utaftaji wa CottonFGD kwa maneno muhimu
Muundo wa awali:
Muundo wa awali wa IDT-qPCR

Ukurasa wa zana ya usanifu wa mtandaoni wa Fig2 IDT

Onyesho la ukurasa wa matokeo ya Fig3
Ubunifu wa vitangulizi vya lncRNA:
lncRNA:hatua sawa na mRNA.
miRNA:Kanuni ya mbinu ya kitanzi cha shina: Kwa kuwa miRNA zote ni mfuatano mfupi wa takriban nt 23, utambuzi wa moja kwa moja wa PCR hauwezi kufanywa, kwa hivyo zana ya mfuatano wa kitanzi cha shina hutumiwa.Mlolongo wa kitanzi cha shina ni DNA ya kamba moja ya takriban 50 nt, ambayo inaweza kuunda muundo wa nywele peke yake.3 'Mwisho unaweza kutengenezwa kama mfuatano unaosaidiana na kipande kidogo cha miRNA, kisha miRNA inayolengwa inaweza kuunganishwa kwenye mfuatano wa kitanzi cha shina wakati wa unukuzi wa kinyume, na urefu wa jumla unaweza kufikia 70bp, ambayo inaambatana na urefu wa bidhaa iliyokuzwa iliyoamuliwa na qPCR.Tailing miRNA primer design.
Utambuzi mahususi wa ukuzaji:
Hifadhidata ya mlipuko mtandaoni: Mlipuko wa CottonFGD kwa mfuatano wa kufanana
Mlipuko wa ndani: Rejelea kutumia Blast+ kufanya mlipuko wa ndani, linux na macos zinaweza kuanzisha moja kwa moja hifadhidata ya ndani, mfumo wa win10 pia unaweza kufanywa baada ya kusakinisha ubuntu bash.Unda hifadhidata ya mlipuko wa ndani na mlipuko wa ndani;fungua ubuntu bash kwenye win10.
Kumbuka: Pamba ya Upland na pamba ya kisiwa cha bahari ni mazao ya tetraploid, kwa hivyo matokeo ya mlipuko mara nyingi yatakuwa mechi mbili au zaidi.Hapo awali, kutumia cd za NAU kama hifadhidata kufanya mlipuko kuna uwezekano wa kupata jeni mbili za homologous na tofauti chache tu za SNP.Kawaida, jeni mbili za homologous haziwezi kutenganishwa na muundo wa primer, kwa hivyo zinachukuliwa kuwa sawa.Ikiwa kuna indel ya wazi, primer kawaida hutengenezwa kwenye indel, lakini hii inaweza kusababisha muundo wa sekondari wa primer Nishati ya bure inakuwa ya juu, na kusababisha kupungua kwa ufanisi wa amplification, lakini hii haiwezi kuepukika.

Utambuzi wa muundo wa sekondari wa primer:
Hatua:fungua oligo 7 → mfuatano wa kiolezo cha ingizo → funga dirisha dogo → hifadhi → tafuta kitangulizi kwenye kiolezo, bonyeza ctrl+D ili kuweka urefu wa kitangulizi → kuchanganua miundo mbalimbali ya upili, kama vile mwili wa kujipunguza, heterodimer, pini ya nywele, kutolingana, n.k. Picha mbili za mwisho kwenye Mchoro 4 ni matokeo ya majaribio ya vianzio.Matokeo ya primer ya mbele ni nzuri, hakuna muundo dhahiri wa dimer na hairpin, hakuna besi za ziada zinazoendelea, na thamani kamili ya nishati ya bure ni chini ya 4.5, wakati primer ya nyuma inaonyesha kuendelea Misingi 6 ni ya ziada, na nishati ya bure ni 8.8;kwa kuongeza, dimer mbaya zaidi inaonekana mwishoni mwa 3, na dimer ya besi 4 mfululizo inaonekana.Ingawa nishati ya bure si ya juu, 3′ dimer Chl inaweza kuathiri pakubwa umaalum wa ukuzaji na ufanisi wa ukuzaji.Kwa kuongeza, ni muhimu kuangalia kwa hairpins, heterodimers, na mismatches.

Fig3 oligo7 matokeo ya kugundua
Utambuzi wa ufanisi wa ukuzaji:
Ufanisi wa ukuzaji wa mmenyuko wa PCR huathiri vibaya matokeo ya PCR.Pia katika qRT-PCR, ufanisi wa ukuzaji ni muhimu sana kwa matokeo ya upimaji.Ondoa vitu vingine, mashine na itifaki katika bafa ya majibu.Ubora wa primers pia una ushawishi mkubwa juu ya ufanisi wa ukuzaji wa qRT-PCR.Ili kuhakikisha usahihi wa matokeo, ukadiriaji wa ujamaa wa fluorescence na ukadiriaji kamili wa fluorescence unahitaji kugundua ufanisi wa ukuzaji wa vianzio.Inatambulika kuwa Ufanisi bora wa ukuzaji wa qRT-PCR ni kati ya 85% na 115%.Kuna njia mbili:
1. Mbinu ya kawaida ya curve:
a.Changanya cDNA
b.Dilution ya gradient
c.qPCR
d.Mlinganyo wa urejeshaji wa mstari ili kukokotoa ufanisi wa ukuzaji
2. LinRegPCR
LinRegPCR ni programu ya uchanganuzi wa Data ya RT-PCR ya wakati halisi, inayoitwa pia data ya kiasi ya PCR (qPCR) kulingana na SYBR Green au kemia sawa.Programu hutumia data iliyosahihishwa isiyo ya msingi, hufanya masahihisho ya msingi kwenye kila sampuli Kando, huamua dirisha la mstari na kisha hutumia uchanganuzi wa urejeshaji wa mstari ili kutoshea mstari ulionyooka kupitia seti ya data ya PCR.Kutoka kwenye mteremko wa mstari huu ufanisi wa PCR wa kila sampuli ya mtu binafsi huhesabiwa.Wastani wa ufanisi wa PCR kwa kila amplikoni na thamani ya Ct kwa kila sampuli hutumika kukokotoa mkusanyiko wa kuanzia kwa kila sampuli, inayoonyeshwa katika vizio vya fluorescence kiholela.Ingizo na matokeo ya data ni kupitia lahajedwali ya Excel.Sampuli pekee
kuchanganya inahitajika, hakuna gradient
hatua zinahitajika:(Chukua Bole CFX96 kama mfano, sio Mashine kabisa iliyo na ABI wazi)
jaribio:ni jaribio la kawaida la qPCR.
Pato la data la qPCR:LinRegPCR inaweza kutambua aina mbili za faili za towe: RDML au matokeo ya Ukuzaji wa idadi.Kwa kweli, ni thamani ya kutambua wakati halisi ya nambari ya mzunguko na ishara ya fluorescence na mashine, na ukuzaji unapatikana kwa kuchambua thamani ya mabadiliko ya fluorescence ya ufanisi wa sehemu ya mstari.
Uchaguzi wa data: Kinadharia, thamani ya RDML inapaswa kutumika.Inakadiriwa kuwa shida ya kompyuta yangu ni kwamba programu haiwezi kutambua RDML, kwa hivyo nina thamani ya matokeo bora kama data asili.Inapendekezwa kufanya uchunguzi mbaya wa data kwanza, kama vile kushindwa kwa kuongeza sampuli, nk pointi zinaweza kufutwa katika data ya pato (bila shaka, huwezi kuzifuta, LinRegPCR itapuuza pointi hizi katika hatua ya baadaye)

Usafirishaji wa data wa Fig5 qPCR

Mtini 6 uteuzi wa sampuli za wagombea

Ingizo la data:Fungua matokeo ya ukuzaji wa sifa.xls, → fungua LinRegPCR → faili → soma kutoka kwa excel → chagua vigezo kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 7 → SAWA → bofya kubainisha misingi

Hatua za 7 za uingizaji wa data wa linRegPCR

Matokeo:Ikiwa hakuna kurudia, hakuna kikundi kinachohitajika.Ikiwa kuna marudio, kikundi kinaweza kuhaririwa katika kikundi cha sampuli, na jina la jeni limeingizwa kwenye kitambulisho, na kisha jeni sawa litawekwa moja kwa moja.Hatimaye, bofya faili, usafirishaji bora, na uone matokeo.Ufanisi wa ukuzaji na matokeo ya R2 ya kila kisima yataonyeshwa.Pili, ukigawanya katika vikundi, ufanisi wa wastani wa ukuzaji utaonyeshwa.Hakikisha kwamba ufanisi wa ukuzaji wa kila primer ni kati ya 85% na 115%.Ikiwa ni kubwa sana au ndogo sana, inamaanisha kuwa ufanisi wa amplification wa primer ni duni.

Mtini 8 Matokeo na matokeo ya data

Mchakato wa majaribio:
Mahitaji ya ubora wa RNA:
Usafi:1.72.0 inaonyesha kuwa kunaweza kuwa na mabaki ya isothiocyanate.Safi nucleic acid A260/A230 inapaswa kuwa karibu 2 .Iwapo kuna ufyonzaji mkali wa nm 230, inaonyesha kuwa kuna misombo ya kikaboni kama vile ioni za phenate.Kwa kuongeza, inaweza kugunduliwa na 1.5% ya electrophoresis ya gel ya agarose.Onyesha alama, kwa sababu ssRNA haina denaturation na logarithm ya uzito wa molekuli haina uhusiano wa mstari, na uzito wa molekuli hauwezi kuonyeshwa kwa usahihi.Kuzingatia: Kinadhariasivyochini ya 100ng/ul, ikiwa ukolezi ni mdogo sana, usafi kwa ujumla ni mdogo si mrefu

Jeli ya RNA ya Kielelezo 9

Kwa kuongeza, ikiwa sampuli ni ya thamani na mkusanyiko wa RNA ni wa juu, inashauriwa kuinukuu baada ya uchimbaji, na kuondokana na RNA hadi mkusanyiko wa mwisho wa 100-300ng/ul kwa unukuzi wa kinyume.Katikamchakato wa unukuzi wa kinyume, mRNA inaponakiliwa, vianzio vya oligo (dt) vinavyoweza kuunganisha kwa mikia ya polyA haswa hutumiwa kwa unukuzi wa kinyume, huku lncRNA na circRNA hutumia vianzio vya hexamer nasibu (Nasibu 6 mer) kwa unukuzi wa kinyume wa jumla ya RNA Kwa miRNA, unukuzi wa msingi maalum wa miRNA hutumika kwa unukuzi wa shingo nyuma.Makampuni mengi sasa yamezindua vifaa maalum vya kuweka mkia.Kwa mbinu ya kitanzi-shina, mbinu ya kushika mkia ni rahisi zaidi, yenye upitishaji wa juu, na inaokoa vitendanishi, lakini Athari ya kutofautisha miRNA ya familia moja haipaswi kuwa nzuri kama mbinu ya kitanzi cha shina.Kila seti ya unukuzi wa kinyume ina mahitaji ya mkusanyiko wa viasili maalum vya jeni (shina-kitanzi).Rejeleo la ndani linalotumika kwa miRNA ni U6.Katika mchakato wa ubadilishaji wa kitanzi cha shina, bomba la U6 linapaswa kuachwa tofauti, na viunga vya mbele na vya nyuma vya U6 vinapaswa kuongezwa moja kwa moja.CircRNA na lncRNA zote zinaweza kutumia HKG kama marejeleo ya ndani.Katikautambuzi wa cDNA,
ikiwa hakuna shida na RNA, cDNA inapaswa pia kuwa sawa.Hata hivyo, ikiwa ukamilifu wa jaribio unafuatiliwa, ni vyema kutumia jeni la marejeleo la ndani (Jeni la Marejeleo, RG) ambalo linaweza kutofautisha gDNA kutoka kwa cd.Kwa ujumla, RG ni jeni la utunzaji wa nyumba., HKG) kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 10;Wakati huo, nilikuwa nikitengeneza protini ya hifadhi ya soya, na nilitumia actin7 iliyo na introni kama marejeleo ya ndani.Ukubwa wa kipande kilichoimarishwa cha kitangulizi hiki katika gDNA kilikuwa 452bp, na ikiwa cDNA ilitumiwa kama kiolezo, ilikuwa 142bp.Kisha matokeo ya jaribio yaligundua kuwa Sehemu ya cDNA ilikuwa imechafuliwa na gDNA, na pia ilithibitisha kuwa hakukuwa na tatizo na matokeo ya unukuzi wa kinyume, na inaweza kutumika kama kiolezo cha PCR.Haina maana kuendesha electrophoresis ya gel ya agarose moja kwa moja na cDNA, na ni bendi ya kuenea, ambayo haishawishi.

Ugunduzi wa cDNA wa 10

Uamuzi wa masharti ya qPCRkwa ujumla hakuna tatizo kulingana na itifaki ya kit, hasa katika hatua ya thamani ya tm.Ikiwa baadhi ya primers hazijaundwa vizuri wakati wa uundaji wa primer, na kusababisha tofauti kubwa kati ya thamani ya tm na 60 ° C ya kinadharia, inashauriwa kuwa cDNA Baada ya sampuli kuchanganywa, endesha PCR ya gradient na primers, na jaribu kuepuka kuweka joto bila bendi kama thamani ya TM.

Uchambuzi wa data

Njia ya kawaida ya usindikaji ya kiasi cha umeme cha jamaa ya PCR kimsingi ni kulingana na 2-ΔΔCT.Kiolezo cha usindikaji wa data.

Bidhaa Zinazohusiana:

Muda Halisi PCR Rahisi^TM -Taqman

Muda Halisi PCR Rahisi^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix kwa mchanganyiko wa kwanza wa cDNA)

RT Easy II(Master Premix kwa mchanganyiko wa kwanza wa cDNA wa qPCR)