Umaalumu wa utambuzi

Katika hali nyingi, madhumuni ya muundo wa primer ni kuongeza maalum ya PCR.Hii imedhamiriwa na ushawishi zaidi au chini unaotabirika wa anuwai nyingi.Tofauti moja muhimu ni mlolongo katika 3′ mwisho wa primer.

Muhimu zaidi, majaribio ya PCR yaliyoundwa kwa ajili ya umaalumu zaidi yana uwezekano mkubwa wa kudumisha ufanisi wa juu juu ya anuwai pana inayobadilika, kwa sababu kipimo hakizalishi bidhaa zisizo maalum za ukuzaji, na hivyo kushindana na vitendanishi vya PCR au kuzuia mwitikio mkuu wa ukuzaji.

Bila shaka, katika baadhi ya matukio, maalum sio muhimu zaidi, kwa mfano, wakati lengo ni kupima kuhusiana kwa karibu lakini pathogens tofauti, muundo maalum, uboreshaji na viwango vya uthibitishaji vinahitajika.

Mviringo wa kuyeyuka ni njia ya kawaida ya kutathmini umaalum wa amplikoni, angalau kwa suala la kukuza lengo moja.Hata hivyo, ni lazima kusisitizwa kwamba mikunjo ya kuyeyuka inaweza kupotosha kwa sababu, kwa mfano, inaweza kuathiriwa na athari za pamoja za vitangulizi vya chini na viwango vya chini vya template.

P5 |Kiwango cha kuyeyuka kinaonyesha mabadiliko ya Tm yaliyopatikana kutoka kwa utambuzi mbili wa viwango tofauti vya DNA mbili lengwa.

A. Katika viwango vya juu (ad)), hakuna kipenyo dhahiri cha kwanza baada ya kipimo cha qPCR kukamilika.Kadiri mkusanyiko wa violezo unavyopungua hadi nakala 50 (e), bidhaa isiyo mahususi huanza kuonekana na kuwa bidhaa pekee katika mkusanyiko wa chini kabisa (f).

B. Jaribio lilirekodi Tms sawa katika viwango vyote vilivyolengwa, na hakukuwa na kipenyo dhahiri cha utangulizi hata katika mkusanyiko wa chini kabisa (nakala 5).Wakati wa kutumia mbinu hizi mbili za utambuzi, hakuna bidhaa za ukuzaji zilizogunduliwa katika NTCs.

P5 inaonyesha mikondo ya myeyusho iliyopatikana kwa sampuli ambazo kiolezo kipo katika viwango tofauti.P 5a inaonyesha kuwa katika viwango viwili vya chini zaidi, Tms ya bidhaa zisizo maalum za amplification zinazozalishwa ni za chini kuliko za amplicon maalum.

Ni wazi, mbinu hii ya ugunduzi haiwezi kutumiwa kwa uaminifu kugundua shabaha ambazo zipo katika viwango vya chini.

Jambo la kufurahisha ni kwamba, NTCs, yaani, sampuli zisizo na DNA kabisa, hazikurekodi bidhaa za ukuzaji (zisizo maalum), ikionyesha kwamba DNA ya jeni ya usuli inaweza kushiriki katika ukuzaji/upolimishaji usio mahususi.

Wakati mwingine viasili kama hivyo vya usuli na ukuzaji usio maalum haviwezi kurekebishwa, lakini mara nyingi inawezekana kubuni mbinu ya kugundua ambayo haina ukuzaji usio maalum katika mkusanyiko wowote wa kiolezo na NTC (P 5b).

Hapa, hata kurekodi upanuzi wa mkusanyiko wa lengo na Cq ya 35 itatoa curve maalum ya kufuta.Vile vile, NTCs hazikuonyesha dalili za ukuzaji usio maalum.Wakati mwingine, tabia ya ugunduzi inaweza kutegemea kileo cha mama, na ukuzaji usio maalum pekee ndio unaotambuliwa katika nyimbo fulani za bafa, ambazo zinaweza kuhusiana na viwango tofauti vya Mg2+.

Utulivu wa utambuzi

Uboreshaji wa Ta ni hatua muhimu katika mchakato wa uthibitishaji na uboreshaji wa utambuzi wa qPCR.Inatoa dalili ya moja kwa moja ya uimara wa primer iliyowekwa kwa kuonyesha halijoto (au anuwai ya halijoto) ambayo hutoa Cq ya chini kabisa bila kukuza NTC.

Tofauti ya mara mbili hadi nne katika unyeti inaweza kuwa si muhimu kwa watu wenye kujieleza kwa juu ya mRNA, lakini kwa vipimo vya uchunguzi, inaweza kumaanisha tofauti kati ya matokeo mazuri na ya uongo.

Sifa za Ta za vianzio vya qPCR zinaweza kutofautiana sana.Majaribio mengine si thabiti sana, na ikiwa hayatafanywa chini ya thamani kamili ya Ta ya vitangulizi, yataanguka haraka.

Hii ni muhimu kwa sababu aina hii ya ugunduzi mara nyingi huwa na matatizo katika ulimwengu wa kweli, na usafi wa sampuli, mkusanyiko wa DNA, au uwepo wa DNA nyingine huenda usiwe bora.

Kwa kuongezea, nambari inayolengwa ya nakala inaweza kutofautiana katika anuwai, na vitendanishi, vyombo vya plastiki, au ala zinaweza kuwa tofauti na zile zinazotumiwa wakati wa kusanidi jaribio.

P6|Kiwango cha halijoto kinaonyesha uimara tofauti wa utambuzi wa PCR.

A. Tumia mchanganyiko mkuu wa Bioline Sensifast SYBR (nambari ya katalogi BIO-98050) kutekeleza PCR kwenye cDNA iliyotayarishwa kutoka kwa RNA ya ubongo wa binadamu.

B. Tumia zana ya CFX qPCR ya Bio-Rad kurekodi ramani ya ukuzaji na mkunjo wa myeyusho wa apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Grafu ya ukuzaji na mkunjo wa kuyeyuka wa ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Grafu ya ukuzaji na mkunjo wa myeyusho wa GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs zilizorekodiwa kwa halijoto tofauti za kuchuja, ikionyesha tofauti katika Cq iliyorekodiwa chini ya kipenyo cha 7C.

P 6 inaonyesha matokeo ya kawaida ya jaribio lisilohitajika, ambapo qPCR ilifanywa kwa kutumia gradient Tas kati ya 59C na 67C (P 6a), kwa kutumia vianzio vya jeni tatu maalum za ubongo wa binadamu.

Inaweza kuonekana kutoka kwa grafu ya ukuzaji kwamba vianzilishi vya Opalin ni mbali na vyema kwa sababu safu yao bora ya Ta ni finyu sana (Mchoro 6b), yaani, Cqs zimetawanywa sana, na kusababisha Cqs kulinganishwa kwa kiasi kikubwa na Cqs zao za Chini.

Mbinu hii ya utambuzi si dhabiti na inaweza kusababisha ukuzaji usiofaa zaidi.Kwa hiyo, jozi hii ya primers inapaswa kuundwa upya.Kwa kuongeza, uchanganuzi wa curve ya kuyeyuka (iliyowekwa) unaonyesha kuwa umaalumu wa njia hii ya utambuzi pia inaweza kuwa na shida, kwa sababu mduara wa kuyeyuka wa kila Ta ni tofauti.

Mbinu ya ugunduzi ya ACSBG1 iliyoonyeshwa katika P 6c ni thabiti zaidi kuliko mbinu ya kugundua Opalin hapo juu, lakini bado iko mbali na bora, na kuna uwezekano kwamba inaweza kuboreshwa.

Hata hivyo, tunasisitiza kwamba hakuna muunganisho wa lazima kati ya uimara na umaalum, kwa sababu mkunjo wa myeyusho unaotolewa na njia hii ya ugunduzi unaonyesha thamani sawa ya kilele katika Tas zote (zilizowekwa).

Kwa upande mwingine, jaribio la uimara ni la kustahimili zaidi, likitoa Cq zinazofanana katika anuwai ya Tas, kama katika jaribio la GFAP lililoonyeshwa kwenye P 6d.

Tofauti katika Cqs zinazopatikana katika safu sawa ya nyuzi joto 8 ni chini ya 1, na mkunjo wa myeyusho (wa kuingiza) huthibitisha sifa za utambuzi katika safu hii ya joto.Ni vyema kutambua kwamba Tas iliyohesabiwa na safu halisi ya Ta inaweza kuwa tofauti sana.

Kuna miongozo mingi iliyoundwa ili kusaidia watafiti kubuni vianzio bora, vingi vikiwa na sheria zilizowekwa kwa muda mrefu na umakini mkubwa umelipwa kwa 3′mwisho wa vianzio.Mara nyingi hupendekezwa kujumuisha G au C mwisho wa 3' na besi mbili za G au C (clamp ya GC), lakini si zaidi ya besi mbili kati ya besi 5 za mwisho.

Katika mazoezi, sheria hizi zinaweza kuongoza watafiti, lakini si lazima kuwa sahihi chini ya hali zote.

P7 |3′mwisho wa primer ina athari kidogo juu ya maalum au ufanisi.

A. Nafasi ya vianzio vya jeni la HIF-1α (NM_181054.2) la binadamu.

B. Tumia Agilent Brilliant III SYBR pombe ya mama ya kijani (Cat. No. 600882) ili kukuza vitu sita vya majaribio.

C. Grafu ya ukuzaji na mkunjo wa kuyeyuka uliorekodiwa na chombo cha CFX qPCR cha Bio-Rad na vianzio 3′end.NTC zinaonyeshwa kwa rangi nyekundu.

Rekodi za D. Cqs za kila kipengee cha jaribio

Kwa mfano, matokeo katika P 7 yanapingana na kanuni ya 3′end.Miundo yote kimsingi hutoa matokeo sawa, na michanganyiko miwili pekee ya vitangulizi inayoongoza kwa ukuzaji usio mahususi katika NTC.

Hata hivyo, hatuwezi kuauni athari ya klipu ya GC, kwa sababu katika kesi hii, kutumia A au T kama upeo wa besi 30 hakupunguzi umaalum.

Jaribio la C, ambapo kitangulizi cha F kinaishia katika GGCC, kilirekodi Cqs katika NTC, ikionyesha kwamba mtu anaweza kutaka kuepuka mfuatano huu mwishoni mwa 30.Tunasisitiza kwamba njia pekee ya kubainisha mfuatano bora zaidi wa 3′ wa jozi ya kwanza ni kutathmini baadhi ya vitangulizi vya watahiniwa kwa majaribio.

Ufanisi wa ukuzaji

Muhimu zaidi, ingawa utambuzi wa PCR usio mahususi hauwezi kamwe kuwa mahususi, ufanisi wa ukuzaji unaweza kurekebishwa na kukuzwa kwa njia nyingi tofauti kwa kubadilisha kimeng'enya, pombe ya mama, viungio na hali ya kuendesha baiskeli.

Ili kutathmini ufanisi wa utambuzi wa PCR, ni bora kutumia dilution ya serial ya mara 10 au 5 ya asidi ya nucleic inayolengwa, yaani, "njia ya kawaida ya curve".

Iwapo amplikoni za PCR au shabaha za DNA sintetiki zitatumika kutengeneza mkunjo wa kawaida, miyeyusho ya mfululizo ya shabaha hizi inapaswa kuchanganywa na kiasi kisichobadilika cha DNA ya usuli (kama vile DNA ya jeni).

P8 |Curve ya dilution ili kutathmini ufanisi wa PCR.

A. Tumia vianzio vya HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA na R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC na Agilent's Brilliant III SYBR Mchanganyiko wa kijani kibichi (nambari ya katalogi 600882) kwa PCR na hali ya kuyeyuka.

B. 100 ng RNA ilinakiliwa kinyume, ilipunguzwa mara 2, na sampuli za cDNA zilizopunguzwa mara kwa mara zilipunguzwa mara 5 hadi 1 ng DNA ya genomic ya binadamu.Kiwango cha kuyeyuka kinaonyeshwa kwenye sehemu ya ndani.

C. Mwitikio wa RT, dilution, na dilution ya mfululizo zilirudiwa kwa sampuli ya pili ya cDNA, na matokeo yalikuwa sawa.

P 8 inaonyesha mikunjo miwili ya kawaida, kwa kutumia mbinu sawa ya kutambua kwenye sampuli mbili tofauti za cDNA, matokeo yake ni ufanisi sawa, takriban 100%, na thamani ya R2 pia inafanana, yaani, kiwango cha kufaa kati ya data ya majaribio na mstari wa kurejesha au Data ya Kiwango cha mstari.

Curve mbili za kawaida zinalinganishwa, lakini sio sawa kabisa.Ikiwa lengo ni kuhesabu kwa usahihi lengo, ni lazima ieleweke kwamba haikubaliki kutoa hesabu ya nambari ya nakala bila kueleza kutokuwa na uhakika.

P9 |Kutokuwa na uhakika wa kipimo kinachohusishwa na ujanibishaji kwa kutumia mkunjo wa kawaida.

A. Tumia vianzio vya GAPDH (NM_002046) kutekeleza PCR na hali ya myeyuko.F: ACAGTTGCCATGTAGACC na R: TAACTGGTTGAGCACAGG na Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nambari ya katalogi BIO-98050).

B. Chati ya ukuzaji, mkunjo unaoyeyuka na mkunjo wa kawaida uliorekodiwa kwa ala ya CFX qPCR ya Bio-Rad.

C. Grafu ya kawaida ya mkunjo na muda wa kutegemewa wa 95% (CI).

D. Nambari ya nakala na muda wa kutegemewa wa 95% wa thamani tatu za Cq zinazotokana na mdundo wa dilution.

P 9 inaonyesha kuwa kwa jaribio lililoboreshwa, utofauti wa asili wa curve moja ya kawaida ni takriban mara 2 (muda wa kutegemewa wa 95%, kiwango cha chini hadi cha juu zaidi), ambacho kinaweza kuwa tofauti ndogo zaidi inayoweza kutarajiwa.

Bidhaa inayohusiana:

Seli ya moja kwa moja ya RT qPCR Kit

Seti ya PCR ya Mkia wa Panya

Seti ya PCR ya Tishu ya Wanyama