Kila mtu anazungumza kuhusu kanuni ya majaribio ya qRT-PCR, muundo wa msingi, tafsiri ya matokeo, n.k., lakini nadhani ni lazima nishiriki nawe uendeshaji wa majaribio wa qRT-PCR.Ni ndogo, lakini ni juu ya matokeo.

Kabla ya kufanya qRT-PCR, tunahitaji kuwa na ufahamu wazi wa RNA yetu wenyewe na mbinu za uendeshaji.Baada ya yote, jitihada zetu zinalenga kupata matokeo, badala ya kufanya mazoezi tu.Kwa hivyo kabla ya kufanya qRT-PCR, tunahitaji kubainisha masuala yafuatayo (ambayo mengine yanatumika kwa SYBR pekee).

1 Je, una uhakika RNA yako haijashushwa hadhi?

NanoDrop 2000 inaweza tu kugundua ukolezi na usafi wa RNA, lakini haiwezi kugundua uadilifu wa RNA.

Nambari ya RNA (RNA Intesity Number) inaweza kuonyesha uadilifu wa RNA, ambao unatambuliwa na mfumo wa Agilent 2100 Bioanalyzer.

Mtini. Mchoro wa mpangilio wa thamani za RIN kwa sampuli tofauti za RNA (eukaryoti)

Walakini, maabara kwa ujumla hazina Agilent 2100 Bioanalyzer.Katika kesi hii, tunaweza kugundua kupitia gel ya formaldehyde, lakini mahitaji ya jumla ya RNA ni ya juu, hivyo njia ya haraka ni kutumia electrophoresis ya gel ya kawaida.Inahitajika kuwa katika mazingira yasiyo na nuclease, kwa hiyo ni muhimu suuza tank ya electrophoresis, chupa ya sol, bracket ya gel na kuchana na maji ya DEPC.Agarose pia haina viini (ilimradi imefunguliwa hivi karibuni), na Bufa ya Kupakia inapaswa kufunguliwa upya iwezekanavyo, kwa gel 1.2%.

Kumbuka kwamba gel lazima kufutwa kabisa, vinginevyo itasababisha bendi inhomogeneous, kama inavyoonekana katika sampuli 9 katika takwimu.Ikiwa voltage ni ya juu sana au inaendeshwa kwa muda mrefu sana itazalisha joto na kusababisha uharibifu wa RNA, hivyo voltage na wakati unapaswa kudhibitiwa kwa sababu.Kwa kuongezea, kukimbia kwa jeli kunaweza pia kuamua zaidi ikiwa kuna mabaki ya DNA kwenye sampuli, na kuchunguza ikiwa kuna idadi kubwa ya bendi zilizobaki kwenye kisima cha kusambaza.

Kielelezo.Gel electrophoresis kugundua ya RNA

2 Je, una uhakika kuhusu mkusanyiko wa cDNA yako?

Uzoefu wa ndugu wakubwa katika maabara ni kwamba cDNA ya mfumo wa 20 ul iliyopatikana kwa kila inversion ni diluted 20X moja kwa moja, wakati dada baada ya daktari ni diluted 10X.Kawaida mimi hutegemea hali hiyo.Kwa sababu ubora wa RNA uliotajwa na kila mtu ni tofauti, kiwango cha kugeuza pia ni tofauti, na teknolojia ya kugeuza inaweza kuwa imara.

Kwa hivyo kila wakati ninapopata cDNA iliyogeuzwa, kwanza nitaipunguza karibu mara 3, na kisha nitumie jeni la utunzaji wa nyumba kufanya RT-PCR, idadi ya mizunguko kwa ujumla ni mizunguko 25, kutambua mkusanyiko maalum, na kisha kuamua sababu ya mwisho ya dilution.

3 Je, una uhakika kwamba vitangulizi vyako ni rahisi kutumia?

Inaweza kupitisha kiwango cha kuyeyuka cha qRT-PCR, lakini hii bado inagharimu pesa.Kwa maabara zisizo na pesa nyingi, wakati wanapata primers nyingi, wanaweza kutumia RT-PCR ya kawaida ili kuona ikiwa ni bendi moja na kutambua maalum ya primers.Ikiwa maabara haina uhaba wa pesa, maalum ya primers zote zinaweza kutambuliwa mara moja kupitia curve ya kuyeyuka.

4 Je, una uhakika kuwa hali zako za majaribio zinafaa?

SYBR inapaswa kulindwa dhidi ya mwanga mkali, kwa hivyo jaribu kuzima mwanga wa juu unapoongeza kitendanishi cha SYBR, na unahitaji tu kutumia mwanga hafifu ili kukikamilisha.

Hifadhi SYBR kwa 4°C.Inapotumika, geuza kwa upole juu na chini ili uchanganye vizuri ili kuepuka kutokwa na povu, na usitoke kwa nguvu.

Dada wengine wachanga hupenda kuchora alama kwenye ubao wa PCR kwa kuogopa kuchanganya sampuli, jambo ambalo si sahihi.Kwa sababu vialamisho vyako vina uwezekano mkubwa wa kuathiri mkusanyiko wa mawimbi ya umeme, kwa ujumla ninapendekeza vijana kutumia daftari za majaribio ili kusaidia katika kumbukumbu, kama inavyoonyeshwa hapa chini.

Kielelezo.mchoro wa upakiaji wa sampuli ya qRT-PCR

5 Je, una uhakika unaifanya ipasavyo?

Hakikisha kuvaa glavu, kuvaa glavu, kuvaa glavu, na kusema mambo muhimu mara tatu.

Ili kupunguza mwangaza wa SYBR, mimi binafsi napenda kuongeza kiolezo kwanza, kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro ulio hapa chini.Kulingana na uzoefu, kuongeza kwa kiasi kidogo cha template kuna uwezekano wa kusababisha makosa ya sampuli.Kwa hiyo, ili kupunguza kosa lililosababishwa na kuongeza kiasi kidogo cha template, mimi kawaida mara mbili sampuli tena, na mara mbili ya kiasi wakati wa kuongeza sampuli ili kupunguza kiasi cha H2O2 kilichoongezwa.

Kielelezo.Mchoro wa mpangilio wa upakiaji wa qRT-PCR

Kisha usanidi mfumo wa qRT-PCR kama ifuatavyo.

Kielelezo.mchoro wa maandalizi ya mfumo wa qRT-PCR

KUMBUKA: Mchakato wa usanidi unahitaji kufanywa kwenye barafu.

Baada ya kuongeza sampuli, weka filamu ya uwazi ya kuziba.Jaribu kugusa uso wa filamu ya kuziba ya uwazi kwa mikono yako, fanya kazi tu kutoka kwenye nafasi pande zote mbili za filamu.Kwa sababu alama za vidole zinaweza pia kuathiri mkusanyiko wa ishara za fluorescent.Kisha tumia centrifuge kwa haraka centrifuge kwa 10 s kwa kasi ya chini ili kuzuia sampuli kutoka kunyongwa juu ya ukuta.

Bidhaa Zinazohusiana:

Seli ya moja kwa moja ya RT-qPCR

RT Rahisi II