PCR ya Wakati Halisi, pia inajulikana kama PCR ya kiasi au qPCR, ni mbinu ya ufuatiliaji na uchambuzi wa wakati halisi wa bidhaa za ukuzaji wa PCR.
Kwa sababu PCR ya kiasi ina faida za uendeshaji rahisi, haraka na rahisi, unyeti wa juu, kurudiwa vizuri, na kiwango cha chini cha uchafuzi, hutumiwa sana katika upimaji wa matibabu, tathmini ya ufanisi wa madawa ya kulevya, utafiti wa usemi wa jeni, utafiti wa mabadiliko ya maumbile, kugundua jeni, kugundua pathojeni, wanyama na mimea., upimaji wa chakula na nyanja zingine.
Kwa hivyo, iwe unajishughulisha na utafiti wa kimsingi katika sayansi ya maisha, au wafanyikazi wa kampuni za dawa, kampuni za ufugaji wa wanyama, kampuni za chakula, au hata wafanyikazi wa ofisi za ukaguzi wa kutoka na karantini, idara za ufuatiliaji wa mazingira, hospitali na vitengo vingine, utakuwa wazi zaidi au chini ya Au unahitaji kujua ujuzi wa kusimamia PCR ya kiasi.

Kanuni ya PCR ya Wakati Halisi

PCR ya Wakati Halisi ni njia ambayo vitu vya umeme huongezwa kwenye mfumo wa mmenyuko wa PCR, na nguvu ya mawimbi ya umeme katika mchakato wa mmenyuko wa PCR hufuatiliwa kwa wakati halisi na kifaa cha kiasi cha PCR, na hatimaye data ya majaribio inachambuliwa na kuchakatwa.

【Mkondo wa kukuza】ni curve inayoelezea mchakato unaobadilika wa PCR.Mviringo wa ukuzaji wa PCR kwa kweli sio mkunjo wa kawaida wa kielelezo, lakini mkunjo wa sigmoid.

[Awamu ya jukwaa ya curve ya ukuzaji]Kwa kuongezeka kwa idadi ya mizunguko ya PCR, kutofanya kazi kwa polimerasi ya DNA, kupungua kwa dNTPs na primers, na kuzuiwa kwa mmenyuko wa awali na mmenyuko wa pyrofosfati ya bidhaa, nk, PCR haina daima kupanua kwa kasi., na hatimaye itaingia kwenye uwanda.

[Eneo la Ukuaji wa Kielelezo wa Curve ya Ukuzaji]Ingawa awamu ya miinuko inatofautiana sana, katika eneo fulani la eneo la ukuaji wa kielelezo cha mkunjo wa ukuzaji, uwezo wa kujirudia ni mzuri sana, ambao ni muhimu sana kwa uchanganuzi wa kiasi cha PCR.

[Thamani ya kizingiti na thamani ya Ct]Tunaweka thamani ya kikomo ya ugunduzi wa umeme katika nafasi ifaayo katika eneo la ukuaji wa kipeo cha mkunjo wa ukuzaji, yaani thamani ya kizingiti (Kizingiti).Makutano ya thamani ya kizingiti na curve ya amplification ni thamani ya Ct, yaani, thamani ya Ct inahusu idadi ya mizunguko (Mzunguko wa Kizingiti) wakati thamani ya kizingiti imefikiwa.

Grafu iliyo hapa chini inaonyesha wazi uhusiano kati ya mstari wa kizingiti na curve ya ukuzaji, kizingiti na thamani ya Ct.

【Jinsi ya kuhesabu?】

Imethibitishwa na nadharia ya hisabati kuwa thamani ya Ct ina uhusiano wa mstari kinyume na logarithm ya idadi ya violezo vya awali.PCR ya Wakati Halisi hufuatilia bidhaa za ukuzaji wa PCR kwa wakati halisi na kuzibainisha wakati wa awamu ya ukuzaji wa kielelezo.

Kwa kila mzunguko wa PCR, DNA iliongezeka kwa kasi kwa mara 2, na hivi karibuni ilifikia uwanda.

Kwa kudhani kuwa kiasi cha kuanzisha DNA ni A₀ , baada ya mizunguko ya n, kiasi cha kinadharia cha bidhaa ya DNA kinaweza kuonyeshwa kama:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Kisha, zaidi ya kiasi cha awali cha DNA A 0, mapema kiasi cha bidhaa iliyokuzwa hufikia thamani ya kugundua An , na idadi ya mizunguko wakati wa kufikia An ni thamani ya Ct.Hiyo ni, kadiri kiwango cha DNA cha awali A 0 kinavyozidi, ndivyo kilele cha curve ya ukuzaji inavyoongezeka, na idadi inayotakiwa ya mizunguko n ni ndogo.

Tunapunguza kiwango cha mkusanyiko unaojulikana na kukitumia kama kiolezo cha PCR ya Wakati Halisi, na mfululizo wa mikondo ya ukuzaji utapatikana kwa vipindi sawa kwa utaratibu wa kuanzisha kiasi cha DNA kutoka zaidi hadi kidogo.Kulingana na uhusiano wa mstari kati ya thamani ya Ct na logariti ya idadi ya violezo vya kuanzia, a[standard curve] inaweza kuundwa .

Kwa kubadilisha thamani ya Ct ya sampuli iliyo na mkusanyiko usiojulikana kwenye mkunjo wa kawaida, kiasi cha awali cha kiolezo cha sampuli yenye mkusanyiko usiojulikana kinaweza kupatikana, ambayo ni kanuni ya kiasi cha Muda Halisi PCR.

Mbinu ya kugundua ya Muda Halisi PCR

PCR ya Wakati Halisi hugundua bidhaa za ukuzaji wa PCR kwa kugundua kiwango cha umeme katika mfumo wa athari.

Kanuni ya Mbinu ya Upachikaji wa Rangi ya Fluorescent】

Rangi za fluorescent, kama vile TB Green ® , inaweza kujifunga kwa DNA yenye nyuzi mbili bila mahususi katika mifumo ya PCR na fluoresce inapofungwa.

Nguvu ya fluorescence katika mfumo wa mmenyuko iliongezeka kwa kasi na ongezeko la mizunguko ya PCR.Kwa kugundua ukubwa wa fluorescence, kiasi cha ukuzaji wa DNA katika mfumo wa majibu kinaweza kufuatiliwa kwa wakati halisi, na kisha kiasi cha kiolezo cha kuanzia kwenye sampuli kinaweza kukadiriwa kinyume.

【Kanuni ya njia ya uchunguzi wa fluorescent】

uchunguzi wa fluorescentni mlolongo wa asidi ya nucleic na kikundi cha fluorescent kwenye mwisho wa 5 na kikundi cha kuzima mwishoni mwa 3′, ambacho kinaweza kuunganisha kwa kiolezo.Wakati probe ni intact, fluorescence iliyotolewa na fluorophore inazimishwa na kikundi cha kuzima na haiwezi fluoresce.Wakati probe imetengana, dutu ya fluorescent itajitenga na kutoa fluorescence.

Kichunguzi cha umeme kinaongezwa kwenye suluhisho la mmenyuko wa PCR.Wakati wa mchakato wa annealing, probe ya fluorescent itafunga kwa nafasi maalum ya template.Wakati wa mchakato wa upanuzi, shughuli ya 5′→3′ exonuclease ya kimeng'enya cha PCR inaweza kuoza chombo cha uchunguzi cha umeme kilichochanganywa na kiolezo, na dutu ya umeme hutenganishwa ili kutoa fluorescence.Kwa kugundua ukubwa wa umeme wa probe katika mfumo wa mmenyuko, madhumuni ya kufuatilia kiasi cha ukuzaji wa bidhaa ya PCR inaweza kupatikana.

【Uteuzi wa Njia ya Kugundua Fluorescence】

Iwapo itatumika kutofautisha mfuatano wenye homolojia ya juu na kufanya utambuzi wa PCR nyingi kama vile uchanganuzi wa kuandika wa SNP, mbinu ya uchunguzi wa fluorescent haiwezi kubadilishwa.
Kwa majaribio mengine ya PCR ya Wakati Halisi, mbinu rahisi, rahisi na ya bei ya chini ya chimera ya umeme inaweza kutumika.

probes Umaalum thabiti, wenye uwezo wa kuzidisha PCR

Upungufu

Mahitaji ya hali ya juu ya ukuzaji;

Multiplex PCR haiwezi kufanywaHaja ya kubuni probe maalum, gharama kubwa;

wakati mwingine probe design ni ngumu

Bidhaa Zinazohusiana: