Katika majaribio ya qPCR, muundo wa primer pia ni kiungo muhimu sana.Ikiwa viasili vinafaa au la inahusiana kwa karibu na iwapo ufanisi wa ukuzaji unafikia kiwango, ikiwa bidhaa zilizoimarishwa ni mahususi, na kama matokeo ya majaribio yanapatikana.
Kwa hivyo jinsi ya kufanya maalum ya qPCR primer bora?Ufanisi wa juu wa ukuzaji?
Leo, tutakupeleka ili kubuni viasili vya qPCR pamoja, na kuruhusu muundo wa qPCR uwe ujuzi bora katika majaribio.
Wakati wa kuunda primers za qPCR, kwa kawaida makini na pointi zifuatazo: primers inapaswa kuundwa kwa introns iwezekanavyo, urefu wa bidhaa unapaswa kuwa 100-300 bp, thamani ya Tm inapaswa kuwa karibu iwezekanavyo hadi 60 ° C, na primers ya juu na ya chini inapaswa kuwa karibu iwezekanavyo, na mwisho wa primer inapaswa kuwa G au C, nk.
1. Ubunifu wa primers zinazozunguka introns
Wakati wa kuunda vianzio vya qPCR, kuchagua vianzio vilivyoundwa kwenye introni kunaweza kuzuia kiolezo cha gDNA kukuzwa, na bidhaa zote zimetokana na ukuzaji wa cDNA, hivyo basi kuondoa ushawishi wa uchafuzi wa gDNA.
2. Urefu wa primer
Urefu wa primer kwa ujumla ni kati ya 18-30 nt, na urefu wa bidhaa ya ukuzaji unapaswa kudhibitiwa kati ya 100-300 bp iwezekanavyo.
Ikiwa primer ni fupi sana, itasababisha amplification isiyo maalum, na ikiwa ni ndefu sana, itaunda kwa urahisi muundo wa sekondari (kama vile muundo wa nywele).Ikiwa bidhaa ya kukuza ni ndefu sana, haifai kwa mmenyuko wa polymerase, ambayo itaathiri ufanisi wa ukuzaji wa PCR.
3. Maudhui ya GC na thamani ya Tm
Yaliyomo ya GC ya vichapishi yanapaswa kudhibitiwa kati ya 40% na 60%.Ikiwa ni ya juu sana au ya chini sana, haifai kuanzisha majibu.Maudhui ya GC ya viasili vya mbele na vya nyuma yanapaswa kuwa karibu na sawa ili kupata thamani sawa ya Tm na halijoto ya kupunguza joto.
Thamani ya Tm inapaswa kuwa kati ya 55-65°C kadri inavyowezekana, kwa ujumla karibu 60°C, na thamani ya Tm ya mto wa juu na chini inapaswa kuwa karibu iwezekanavyo, ikiwezekana isizidi 4°C.
4. Epuka kuchagua A mwishoni mwa 3′ ya kitangulizi
Wakati mwisho wa 3′ wa primer haufananishwi, kuna tofauti kubwa katika ufanisi wa awali wa besi tofauti.Wakati msingi wa mwisho ni A, inaweza pia kuanzisha awali ya mnyororo hata katika kesi ya kutofautiana, na wakati msingi wa mwisho ni T Wakati, ufanisi wa uingizaji usiofaa umepunguzwa sana.Kwa hivyo, jaribu kuzuia kuchagua A mwishoni mwa 3′ ya primer, na ni bora kuchagua T.
Ikiwa ni kitangulizi cha uchunguzi, mwisho wa 5′ wa uchunguzi hauwezi kuwa G, kwa sababu hata wakati msingi mmoja wa G umeunganishwa kwenye kikundi cha waandishi wa habari wa fluorescent wa FAM, G inaweza pia kuzima mawimbi ya umeme iliyotolewa na kikundi cha FAM, na hivyo kusababisha matokeo mabaya ya uongo.Onekana.
5. Usambazaji wa msingi
Usambazaji wa besi nne kwenye kianzio bora ni wa nasibu, ukiepuka zaidi ya G au C 3 mfululizo mwishoni mwa 3′, na zaidi ya 3 mfululizo.G au C ni rahisi kutengeneza kuoanisha katika eneo la mfuatano wa GC-tajiri.
6. Kanda ya kubuni ya primer inapaswa kuepuka miundo tata ya sekondari.
Muundo wa pili unaoundwa na uzi mmoja wa bidhaa ya kukuza utaathiri maendeleo laini ya PCR.Kwa kutabiri ikiwa kuna muundo wa sekondari katika mlolongo wa lengo mapema, jaribu kuepuka eneo hili katika kubuni ya primers.
7. The primers wenyewe na kati ya primers wanapaswa kujaribu kuzuia mfululizo wa besi za ziada.
Hakuwezi kuwa na ukamilishano wa msingi 4 mfululizo kati ya kitangulizi chenyewe na kitangulizi.Primer yenyewe haipaswi kuwa na mlolongo wa ziada, vinginevyo itajikunja ili kuunda muundo wa hairpin, ambayo itaathiri mchanganyiko wa annealing wa primer na template.
Mifuatano ya ziada haiwezi kuwepo kati ya vianzio vya juu na vya chini vya mkondo.Kukamilishana kati ya primers kutazalisha dimers za msingi, ambazo zitapunguza ufanisi wa PCR na hata kuathiri usahihi wa kiasi.Ikiwa miundo ya primer-dimer na hairpin haiwezi kuepukika, thamani ya △G haipaswi kuwa juu sana (inapaswa kuwa chini ya 4.5 kcal/mol).
8. Primers huongeza bidhaa inayolengwa.
Lengo kuu la ugunduzi wa qPCR ni kuelewa wingi wa jeni lengwa.Ikiwa amplification isiyo maalum hutokea, quantification itakuwa sahihi.Kwa hiyo, baada ya primers iliyoundwa, wanahitaji kupimwa na BLAST, na maalum ya bidhaa ni ikilinganishwa katika database mlolongo.
Kisha, tunachukua jeni la binadamu la GAS6 (Growth arrest specific 6) kama mfano wa kubuni vianzio vya qPCR.
01 jeni la swali
Homo GAS6kupitia NCBI.Hapa, tunapaswa kuzingatia kulinganisha jina la jeni na spishi ili kuhakikisha kuwa zinalingana.
02 Tafuta mfuatano wa jeni
(1) Ikiwa mfuatano unaolengwa ni DNA ya jeni, chagua wa kwanza, ambao ni mfuatano wa DNA ya jeni.
(2) Ikiwa mfuatano unaolengwa ni mRNA, chagua wa pili.Baada ya kuingia, bofya "CDS" katika jedwali lililo hapa chini.Mfuatano wa mandharinyuma ya kahawia ni mfuatano wa usimbaji wa jeni.
03 Vitangulizi vya kubuni
Ingiza kiolesura cha Primer-BLAST
Ingiza nambari ya mfuatano wa jeni au mfuatano katika umbizo la Fasta upande wa juu kushoto, na ujaze vigezo vinavyohusika.

Bofya "Pata vianzio" na NCBI itajitokeza ili kukuambia kuwa uteuzi huo wa vigezo utakuzwa kwa vibadala vingine vya kuunganisha.Tunaweza kuangalia lahaja tofauti za kuunganisha na kuziwasilisha ili kupata jozi ya kwanza inayofaa (kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro hapa chini).Mchakato huu unaweza kuchukua makumi ya sekunde kukimbia.
Viwango vya joto vya jozi hizi za kwanza ni karibu 60 ° C.Kwa mujibu wa madhumuni ya jaribio, chagua primers na urefu wa wastani, maalum nzuri na ukamilishaji mdogo wa utangulizi wa majaribio, na kiwango cha mafanikio ni cha juu kabisa!
04Uthibitishaji wa umaalum wa kwanza
Kwa kweli, pamoja na kubuni vianzio, Primer-Blast pia inaweza kutathmini vianzio ambavyo tumeviunda sisi wenyewe.Rudi kwenye ukurasa wa usanifu wa kitangulizi, weka vianzilishi vya juu na vya chini vya mkondo tuliotengeneza, na vigezo vingine havitarekebishwa.Baada ya kuwasilisha, unaweza kuona ikiwa jozi za viunzilishi pia zipo kwenye jeni zingine.Ikiwa zote zinaonyeshwa kwenye jeni tunayotaka kukuza, ikionyesha kuwa maalum ya jozi hii ya primers ni nzuri!(Kwa mfano, haya ndiyo matokeo pekee ya swali la kwanza!)

05 Hukumu ya ubora wa kwanza
Je, ni kitangulizi cha aina gani "kikamilifu" kinachochanganya "ufanisi wa ukuzaji hadi kiwango", "sifa za bidhaa zilizoimarishwa", na "matokeo ya majaribio ya kuaminika"?
Ufanisi wa ukuzaji

kuyeyuka curve
Ufanisi wa amplification wa primers hufikia 90% -110%, ambayo ina maana kwamba ufanisi wa amplification ni nzuri, na curve ya kuyeyuka ina kilele kimoja na kwa kawaida Tm> 80 ° C, ambayo ina maana kwamba maalum ya amplification ni nzuri.
 
Bidhaa Zinazohusiana:
Muda Halisi PCR Easy–SYBR GREEN I
Muda Halisi PCR Easy-Taqman