Msingi wa muundo wa msingi (shida 99% zinaweza kutatuliwa)
1. Urefu wa kwanza: Kitabu cha kiada kinahitaji 15-30bp, kwa kawaida kama 20bp.Hali halisi ni bora kuwa 18-24bp ili kuhakikisha maalum, lakini muda mrefu zaidi, primer ndefu pia itapunguza maalum, na kupunguza mavuno.
2. Muda wa ukuzaji wa primer: 200-500bp inafaa, na kipande kinaweza kupanuliwa hadi 10kb chini ya hali maalum.
3. Msingi wa msingi: Maudhui ya G+C yanapaswa kuwa 40-60%, athari ndogo sana ya ukuzaji wa G+C si nzuri, G+C nyingi sana ni rahisi kuonekana bendi zisizo maalum.ATGC inasambazwa vyema kwa nasibu, kuepuka makundi ya zaidi ya 5 purine au pyrimidine nucleotides.Multi-gc ya mwisho wa 5′ na mfuatano wa kati ili kuongeza uthabiti, epuka GC tajiri mwisho wa 3′, hakuna GC kwa besi 3 zilizopita, au hakuna GC kwa besi 3 kati ya 5 zilizopita.
4. Epuka muundo wa pili katika vianzio, na uepuke ukamilishaji kati ya vianzio viwili, hasa ukamilishaji mwishoni mwa 3, vinginevyo kipenyo cha kwanza kitaundwa na bendi zisizo maalum za amplisi zitatolewa.
5. Besi kwenye sehemu 3 za mwisho za vianzio, haswa besi za mwisho na za mwisho, zinapaswa kuunganishwa kikamilifu ili kuzuia kushindwa kwa PCR kwa sababu ya besi za terminal ambazo hazijaoanishwa.
6. Viunzilishi vina au vinaweza kuongezwa na tovuti zinazofaa za kupasua, na mfuatano wa lengo ulioimarishwa unapaswa kuwa na tovuti zinazofaa za kupasua, ambayo ni ya manufaa sana kwa uchanganuzi wa mipasuko au uunganishaji wa molekuli.
7. Umaalumu wa primers: primers haipaswi kuwa na homolojia dhahiri na mlolongo mwingine katika hifadhidata ya mlolongo wa asidi nucleic.
8. Jifunze kutumia programu: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Muundo huu wa mtandaoni hufanya kazi vizuri zaidi).
Yaliyomo hapo juu yanaweza kutatua angalau 99% ya shida za muundo wa primer.
Dhibiti maelezo ya muundo wa primer
1. Urefu wa primer
Urefu wa jumla wa primer ni besi 18-30.Kwa ujumla, jambo muhimu zaidi la kuamua joto la annealing ya primer ni urefu wa primer.Kiwango cha joto cha anneal cha primer kwa ujumla huchaguliwa (thamani ya Tm -5℃), na baadhi hutumia thamani ya Tm moja kwa moja.Fomula zifuatazo zinaweza kutumika kukokotoa takriban halijoto ya kupenyeza ya viunzio.
Wakati urefu wa primer ni chini ya 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Wakati urefu wa primer ni kubwa kuliko 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/urefu-5℃
Kwa kuongeza, programu nyingi zinaweza pia kutumika kuhesabu joto la annealing, kanuni ya hesabu itakuwa tofauti, hivyo wakati mwingine thamani iliyohesabiwa inaweza kuwa na pengo ndogo.Ili kuboresha athari za PCR, vianzio vifupi zaidi vinavyohakikisha halijoto isiyopungua 54℃ hutumika kwa utendakazi na umaalum bora zaidi.
Kwa ujumla, umaalum wa primer huongezeka kwa sababu ya nne kwa kila nyukleotidi ya ziada, ili urefu wa chini wa primer kwa matumizi mengi ni nyukleotidi 18.Upeo wa juu wa urefu wa primer sio muhimu sana, hasa kuhusiana na ufanisi wa majibu.Kwa sababu ya entropy, kadiri kitangulizi kinavyokuwa kirefu, ndivyo kasi inavyopungua ili kujifunga kwenye DNA inayolengwa ili kuunda kiolezo thabiti chenye ncha mbili cha DNA polima ili kumfunga.
Unapotumia programu kuunda vianzio, urefu wa vianzio unaweza kuamuliwa na thamani ya TM kwa zamu, hasa kwa viasili vya kiasi cha fluorescence PCR, TM=60℃ au hivyo vinapaswa kudhibitiwa.
Maudhui ya 2.GC
Kwa ujumla, maudhui ya G+C katika mfuatano wa kwanza ni 40%~60%, na maudhui ya GC na thamani ya Tm ya jozi ya vianzio inapaswa kuratibiwa.Ikiwa kitangulizi kina mwelekeo wa A GC au AT, kiasi kinachofaa cha A, T au G na C mkia kinaweza kuongezwa hadi mwisho wa 5 wa kianzio.
3. Joto la kuchuja
Joto la kuchungia linapaswa kuwa 5 ℃ chini kuliko halijoto isiyo na mnyororo.Ikiwa idadi ya besi za msingi ni ndogo, joto la anneal linaweza kuongezeka ipasavyo, ambayo inaweza kuongeza maalum ya PCR.Ikiwa idadi ya besi ni kubwa, joto la anneal inaweza kupunguzwa ipasavyo.Tofauti ya halijoto ya annealing kati ya jozi ya viunzio vya 4℃ ~ 6℃ haitaathiri mavuno ya PCR, lakini kwa hakika halijoto ya annealing ya jozi ya primers ni sawa, ambayo inaweza kutofautiana kati ya 55℃ ~ 75℃.
4. Epuka eneo la muundo wa sekondari wa template ya kukuza
Ni bora kuepuka eneo la muundo wa sekondari wa template wakati wa kuchagua fragment iliyokuzwa.Muundo thabiti wa pili wa kipande lengwa unaweza kutabiriwa na kukadiriwa na programu husika ya kompyuta, ambayo ni muhimu kwa uteuzi wa violezo.Matokeo ya majaribio yanaonyesha kuwa upanuzi mara nyingi haufaulu wakati nishati isiyolipishwa (△G) ya eneo litakalopanuliwa ni chini ya 58.6lkJ/mol.
5. Kutolingana na DNA inayolengwa
Wakati mfuatano wa DNA lengwa ulioimarishwa ni mkubwa, kitangulizi kinaweza kushikamana na sehemu nyingi za DNA inayolengwa, na kusababisha bendi nyingi kuonekana kwenye matokeo.Wakati huu ni muhimu kutumia majaribio ya programu ya BLAST, tovuti:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Chagua Pangilia mifuatano miwili (bl2seq).
Kubandika mifuatano ya vianzio kwenye ukanda wa 1 na kulenga mifuatano ya DNA kwenye eneo la 2 kunaweza kubadilishana, na BLAST hukokotoa nyongeza, antisense, na uwezekano mwingine, kwa hivyo watumiaji hawahitaji kutambua kama misururu yote miwili ni minyororo ya hisia.Unaweza pia kuingiza nambari ya GI ikiwa unajua nambari ya GI ya mlolongo kwenye hifadhidata, kwa hivyo sio lazima ubandike sehemu kubwa ya mlolongo.Hatimaye, bofya Pangilia saa 3 ili kuona kama kitangulizi kina tovuti nyingi zenye homologous katika DNA inayolengwa.
6. Primer terminal
Mwisho wa 3 wa primer ndipo ugani unapoanza, kwa hivyo ni muhimu kuzuia kutolingana kuanza hapo.Mwisho wa 3 haufai kuwa zaidi ya G au C 3 mfululizo, kwa sababu hii itasababisha kianzilishi kuanzishwa kimakosa katika eneo la mfuatano wa uboreshaji wa G+C.Mwisho wa 3 hauwezi kuunda muundo wowote wa pili, isipokuwa katika miitikio maalum ya PCR (AS-PCR), mwisho wa 3′ wa kianzilishi hauwezi kulinganishwa.Kwa mfano, ikiwa eneo la usimbaji limeimarishwa, mwisho wa 3 wa primer haipaswi kusitishwa katika nafasi ya tatu ya kodoni, kwa sababu nafasi ya tatu ya kodoni inakabiliwa na kuzorota, ambayo itaathiri maalum na ufanisi wa amplification.Unapotumia viambajengo vya kuambatanisha, rejelea jedwali la matumizi ya kodoni, makini na upendeleo wa kibiolojia, usitumie viambajengo vya viambatisho kwenye mwisho wa 3′, na tumia mkusanyiko wa juu wa vianzio (1uM-3uM).
7. Muundo wa sekondari wa primers
Watangulizi wenyewe hawapaswi kuwa na mlolongo wa ziada, vinginevyo watangulizi wenyewe wataingia kwenye miundo ya nywele, na muundo huu wa sekondari utaathiri kumfunga kwa primers na templates kutokana na kizuizi cha steric.Ikiwa hukumu ya bandia inatumiwa, besi za ziada zinazoendelea za primers hazipaswi kuwa kubwa kuliko 3bp.Haipaswi kuwa na ukamilishano kati ya vianzio viwili, hasa mwingiliano wa ziada wa mwisho wa 3 unapaswa kuepukwa ili kuzuia uundaji wa vipima vya utangulizi.Kwa ujumla, kusiwe na zaidi ya misingi 4 mfululizo ya homolojia au ukamilishano kati ya jozi ya vitangulizi.
8. Ongeza alama au loci
Mwisho wa 5 'una athari kidogo kwenye umaalum wa ukuzaji na kwa hivyo unaweza kurekebishwa bila kuathiri umaalum wa ukuzaji.Marekebisho ya mwisho ya primer 5 ni pamoja na: kuongeza tovuti ya kizuizi cha enzyme;Biotin iliyo na lebo, fluorescence, digoxin, Eu3+, n.k. Tambulisha mfuatano wa DNA unaofunga protini;Kuanzisha tovuti za mabadiliko, kuingiza na kukosa mpangilio wa mabadiliko na kuanzisha mpangilio wa vikuzaji, n.k. Misingi ya ziada itaathiri zaidi au kidogo ufanisi wa ukuzaji na kuongeza nafasi ya uundaji wa kipenyo cha kwanza, lakini makubaliano fulani lazima yafanywe kwa hatua inayofuata.Misururu ya ziada ambayo haipo kwenye mfuatano unaolengwa, kama vile tovuti za vizuizi na mifuatano ya waendelezaji, inaweza kuongezwa kwenye mwisho wa 5′ wa kitangulizi bila kuathiri umahususi.Mifuatano hii haijajumuishwa katika hesabu ya thamani za msingi za Tm, lakini inapaswa kujaribiwa kwa ukamilishano na muundo wa upili wa ndani.
9. Subcloni
Mara nyingi, PCR ni uundaji wa awali tu, na kisha tunahitaji kupunguza kipande kinacholengwa ndani ya vekta mbalimbali, kwa hivyo tunahitaji kubuni besi za ziada za operesheni inayofuata katika hatua ya PCR.
Baadhi ya mifuatano iliyoundwa kwa ajili ya ujumuishaji mdogo imefupishwa hapa chini.
Tovuti ya kizuizi ya endonuclease ya kizuizi imeongezwa
Kuongeza tovuti za vizuizi vya kimeng'enya ndiyo njia inayotumika sana kwa kupunguza bidhaa za PCR.Kwa ujumla, tovuti cleavage ni besi sita, pamoja na 5 'mwisho wa tovuti cleavage haja ya kuongeza 2 ~ 3 besi za kinga.Hata hivyo, idadi ya besi za kinga zinazohitajika na enzymes tofauti ni tofauti.Kwa mfano, SalⅠ haihitaji msingi wa ulinzi, EcoRⅤ inahitaji besi 1 ya ulinzi, NotⅠ inahitaji besi 2 za ulinzi, na Hind Ⅲ inahitaji besi 3 za ulinzi.
LIC inaongeza mkia
Jina kamili la LIC ni Uunganishaji-Kujitegemea wa cloning, mbinu ya uundaji iliyobuniwa na Navogen haswa kwa sehemu yake ya vekta ya pET.Mtoa huduma wa pET iliyotayarishwa kwa mbinu ya LIC ina ncha zisizokamilishana za nyuzi 12-15 za msingi mmoja, zinazosaidiana na ncha zinazonata kwenye kipande cha kuingiza lengwa.Kwa madhumuni ya ukuzaji, primer 5′ mlolongo wa kipande kilichoingizwa inapaswa kukamilisha vekta ya LIC.Shughuli ya 3′→5′ ya polimerasi ya T4 DNA inaweza kuunda ncha moja ya kunata kwenye kipande kilichoingizwa baada ya muda mfupi.Kwa sababu bidhaa inaweza tu kuundwa kutoka kwa annealing ya pamoja ya kipande cha kuingiza kilichoandaliwa na vector, njia hii ni ya haraka sana na yenye ufanisi, na inaelekezwa cloning.
Imeelekezwa TA clone kuongeza mkia
Uundaji wa TA haukuweza kulenga kipande hicho kuwa vekta, kwa hivyo baadaye Invitrogen ilianzisha vekta ambayo inaweza kulenga uundaji wa cloning, ambayo ilikuwa na GTGGS nne mashuhuri kwa upande mmoja.Kwa hiyo, katika kubuni ya primers za PCR, mlolongo wa ziada unapaswa kuongezwa ipasavyo, ili vipande vinaweza "kuelekezwa".
Ikiwa una muda mfupi, unaweza kujaribu usanisi wa moja kwa moja, ukichanganya jeni na vekta, ambayo ndiyo tunaita usanisi wa jeni wa ET katika wanamusekulari.
D. In-Fusion njia ya cloning
Hakuna ligase inahitajika, hakuna majibu ya muda mrefu inahitajika.Kwa muda mrefu kama mlolongo katika ncha zote mbili za vector linearized ni kuletwa Katika kubuni ya primers, basi bidhaa PCR na vector linearized ni aliongeza katika ufumbuzi in-fusion enzyme zenye BSA na kuwekwa kwenye joto la kawaida kwa nusu saa, mabadiliko yanaweza kufanywa.Njia hii inafaa hasa kwa ubadilishaji wa kiasi kikubwa.
10. Unganisha primer
Wakati mwingine, habari ndogo tu ya mlolongo hujulikana kuhusu muundo wa primer.Kwa mfano, ikiwa tu mlolongo wa asidi ya amino hujulikana, primer ya kuunganisha inaweza kuundwa.Kitangulizi cha kuunganisha ni mchanganyiko wa mfuatano tofauti unaowakilisha uwezekano wote tofauti wa msingi ambao husimba asidi moja ya amino.Ili kuongeza umaalum, unaweza kurejelea jedwali la matumizi ya kodoni ili kupunguza uwekaji kulingana na upendeleo wa matumizi ya msingi wa viumbe tofauti.Hypoxanthine inaweza kuunganishwa na besi zote ili kupunguza joto la anneal ya primer.Usitumie besi zilizoambatishwa kwenye 3′ mwisho wa kianzio kwa sababu uwekaji wa besi 3 za mwisho kwenye mwisho wa 3′ inatosha kuanzisha PCR kwenye tovuti isiyo sahihi.Viwango vya juu vya utangulizi (1μM hadi 3μM) hutumiwa kwa sababu vianzio katika michanganyiko mingi ya viambatisho si mahususi kwa kiolezo lengwa.
Malighafi ya PCRkudhibiti
1. Primer wingi
Mkusanyiko wa kila primer ni 0.1 ~ 1umol au 10 ~ 100pmol.Ni bora kutoa matokeo yanayohitajika na kiwango cha chini cha primer.Mkusanyiko wa juu wa primer itasababisha upanuzi usiolingana na usio maalum, na kuongeza nafasi ya kuunda dimers kati ya primers.
2. Mkusanyiko wa primer
Mkusanyiko wa primers huathiri maalum.Mkusanyiko bora wa primer kwa ujumla ni kati ya 0.1 na 0.5μM.Viwango vya juu vya primer husababisha ukuzaji wa bidhaa zisizo maalum.
3. Annealing joto ya primer
Kigezo kingine muhimu kwa primers ni joto la kuyeyuka (Tm).Hili ndilo halijoto wakati 50% ya vianzio na mifuatano ya ziada inawakilishwa kama molekuli za DNA zenye nyuzi mbili.Tm inahitajika ili kuweka halijoto ya kuzuia joto ya PCR.Kwa hakika, halijoto ya kuchuja ni ya chini vya kutosha ili kuhakikisha uingizaji bora wa vianzio kwa mlolongo lengwa, lakini juu ya kutosha ili kupunguza ufungaji usio maalum.Joto la kufaa la kuchungia kutoka 55 ℃ hadi 70 ℃.Joto la kuchuja kwa ujumla huwekwa chini ya 5℃ kuliko Tm ya primer.
Kuna fomula kadhaa za kuweka Tm, ambazo hutofautiana sana kulingana na fomula iliyotumiwa na mlolongo wa vitangulizi.Kwa sababu fomula nyingi hutoa makadirio ya thamani ya Tm, halijoto zote za kupunguza joto ni mahali pa kuanzia.Umaalumu unaweza kuboreshwa kwa kuchanganua miitikio kadhaa ambayo hupandisha halijoto hatua kwa hatua.Anza chini ya makadirio ya Tm-5℃, na hatua kwa hatua ongeza halijoto ya uchujaji katika nyongeza ya 2℃.Joto la juu la annealing litapunguza uundaji wa dimers za primer na bidhaa zisizo maalum.Kwa matokeo bora zaidi, vianzio viwili vinapaswa kuwa na takriban thamani za Tm.Ikiwa tofauti ya Tm ya jozi za primer ni zaidi ya 5℃, vianzio vitaonyesha mwanzo wa uwongo kwa kutumia halijoto ya chini ya anneal katika mzunguko.Ikiwa vianzio viwili vya Tm ni tofauti, weka halijoto ya anneal hadi 5℃ chini kuliko Tm ya chini kabisa.Vinginevyo, ili kuongeza umaalum, mizunguko mitano inaweza kutekelezwa kwanza katika halijoto ya kupitishia hewa iliyoundwa kwa Tm ya juu zaidi, ikifuatiwa na mizunguko iliyosalia katika viwango vya joto vilivyoundwa kwa Tm ya chini.Hii inaruhusu nakala ya sehemu ya kiolezo lengwa kupatikana chini ya hali ngumu.
4. Primer usafi na utulivu
Usafi wa kawaida wa vitangulizi maalum ni vya kutosha kwa programu nyingi za PCR.Uondoaji wa vikundi vya benzoyl na isobutylyl kwa kuondoa chumvi ni mdogo na kwa hivyo hauingilii PCR.Baadhi ya programu zinahitaji utakaso ili kuondoa mfuatano wowote usio wa urefu kamili katika mchakato wa usanisi.Mifuatano hii iliyopunguzwa hutokea kwa sababu ufanisi wa kemia ya awali ya DNA sio 100%.Huu ni mchakato wa mduara unaotumia athari za kemikali mara kwa mara kwani kila msingi huongezwa kutengeneza DNA kutoka 3′ hadi 5′.Unaweza kushindwa katika mzunguko wowote.Vitambulisho virefu zaidi, hasa vile besi kubwa zaidi ya 50, vina idadi kubwa ya mifuatano iliyopunguzwa na huenda ikahitaji utakaso.
Mavuno ya primers huathiriwa na ufanisi wa kemia ya synthetic na njia ya utakaso.Kampuni za dawa za mimea, kama vile Cytology na Shengong, zote hutumia kiwango cha chini cha OD ili kuhakikisha jumla ya pato la oligonucleoside.Primers maalum husafirishwa kwa fomu ya poda kavu.Ni bora kufuta tena primers katika TE ili mkusanyiko wa mwisho ni 100μM.TE ni bora kuliko maji yaliyotengwa kwa sababu pH ya maji mara nyingi ni tindikali na itasababisha hidrolisisi ya oligonucleosides.
Utulivu wa primers inategemea hali ya kuhifadhi.Poda kavu na primers iliyoyeyushwa inapaswa kuhifadhiwa kwa -20 ℃.Primers zilizoyeyushwa katika TE katika viwango vya zaidi ya 10μM zinaweza kuhifadhiwa kwa uthabiti kwa -20℃ kwa miezi 6, lakini zinaweza tu kuhifadhiwa kwenye joto la kawaida (15℃ hadi 30℃) kwa chini ya wiki 1.Vipuli vya poda kavu vinaweza kuhifadhiwa kwa -20 C kwa angalau mwaka 1 na kwenye joto la kawaida (15 C hadi 30 C) kwa hadi miezi 2.
5. Enzymes na viwango vyao
Kwa sasa, polimerasi ya Taq DNA inayotumiwa kimsingi ni kimeng'enya cha uhandisi wa jeni kilichosanifiwa na bakteria ya coliform.Kiasi cha kimeng'enya kinachohitajika ili kuchochea mmenyuko wa kawaida wa PCR ni kama 2.5U (inarejelea jumla ya ujazo wa 100ul).Ikiwa mkusanyiko ni wa juu sana, inaweza kusababisha amplification isiyo maalum;ikiwa ukolezi ni mdogo sana, kiasi cha bidhaa za synthetic kitapungua.
6. Ubora na mkusanyiko wa dNTP
Ubora wa dNTP unahusiana kwa karibu na ukolezi na ufanisi wa ukuzaji wa PCR.Poda ya dNTP ni punjepunje, na kutofautiana kwake hupoteza shughuli zake za kibiolojia ikiwa imehifadhiwa vibaya.Suluhisho la dNTP lina tindikali, na linapaswa kutumika katika mkusanyiko wa juu, likiwa na suluhu ya 1M NaOH au 1M Tris.HCL ili kurekebisha PH yake hadi 7.0 ~ 7.5, kiasi kidogo cha kifungashio, hifadhi iliyogandishwa ifikapo -20℃.Kufungia mara nyingi kutaharibu dNTP.Katika majibu ya PCR, dNTP inapaswa kuwa 50 ~ 200umol/L.Hasa, tahadhari inapaswa kulipwa kwa mkusanyiko wa DNTPS nne inapaswa kuwa sawa (maandalizi sawa ya mole).Ikiwa mkusanyiko wa yoyote kati yao ni tofauti na wengine (juu au chini), kutolingana kutasababishwa.Mkusanyiko wa chini sana utapunguza mavuno ya bidhaa za PCR.dNTP inaweza kuunganishwa na Mg2+ na kupunguza mkusanyiko wa Mg2+ ya bure.
7. Template (lengo gene) asidi nucleic
Kiasi na kiwango cha utakaso wa asidi nucleic ya kiolezo ni mojawapo ya viungo muhimu vya kufaulu au kushindwa kwa PCR.Mbinu za jadi za utakaso wa DNA kwa kawaida hutumia SDS na protease K ili kuyeyusha na kutupa vielelezo.Kazi kuu za SDS ni: kufuta lipids na protini kwenye membrane ya seli, hivyo kuharibu utando wa seli kwa kufuta protini za membrane, na kutenganisha protini za nyuklia katika seli, SDS inaweza pia kuchanganya na protini na precipitate;Protease K inaweza kutayarisha hidrolisisi na kuyeyusha protini, hasa histones zinazofungamana na DNA, na kisha kutumia fenoli ya kikaboni ya kutengenezea na klorofomu kutoa protini na viambajengo vingine vya seli, na kutumia ethanoli au alkoholi ya isopropili kumwagisha asidi nucleic.Asidi ya nyukilia iliyotolewa inaweza kutumika kama kiolezo cha athari za PCR.Kwa vielelezo vya jumla vya ugunduzi wa kimatibabu, mbinu ya haraka na rahisi inaweza kutumika kutengenezea seli, kusate vimelea vya magonjwa, kuyeyusha na kuondoa protini kutoka kwa kromosomu hadi jeni zinazolengwa bila malipo, na kutumika moja kwa moja kwa ukuzaji wa PCR.Uchimbaji wa kiolezo cha RNA kwa kawaida hutumia mbinu ya guanidine isothiocyanate au protease K ili kuzuia RNase dhidi ya kuharibu RNA.
8.Mg2+ ukolezi
Mg2+ ina athari kubwa kwa umaalum na mavuno ya ukuzaji wa PCR.Kwa ujumla mmenyuko wa PCR, wakati mkusanyiko wa dNTP mbalimbali ni 200umol/L, ukolezi unaofaa wa Mg2+ ni 1.5 ~ 2.0mmol/L.Mkusanyiko wa Mg2+ ni wa juu sana, umaalumu wa mmenyuko hupungua, ukuzaji usio maalum hutokea, ukolezi mdogo sana utapunguza shughuli za Taq DNA polymerase, na kusababisha kupunguzwa kwa bidhaa za majibu.
Ioni za magnesiamu huathiri vipengele kadhaa vya PCR, kama vile shughuli ya DNA polymerase, ambayo huathiri mavuno;Mfano mwingine ni primer annealing, ambayo huathiri maalum.dNTP na kiolezo hufungamana na ioni ya magnesiamu, hivyo basi kupunguza kiwango cha ioni ya magnesiamu isiyolipishwa inayohitajika kwa shughuli ya kimeng'enya.Mkusanyiko bora wa ioni ya magnesiamu hutofautiana kwa jozi na violezo tofauti vya primer, lakini mkusanyiko wa kawaida wa PCR unaoanza na 200μM dNTP ni 1.5mM (kumbuka: Kwa PCR ya muda halisi, tumia suluhu ya ioni ya magnesiamu 3 hadi 5mM na uchunguzi wa fluorescent).Viwango vya juu vya ioni za magnesiamu huongeza mavuno, lakini pia huongeza ukuzaji usio maalum na kupungua kwa uaminifu.Ili kuamua ukolezi bora zaidi, viwango vya ioni vya magnesiamu vilifanywa kwa nyongeza za 0.5mM kutoka 1mM hadi 3mM.Ili kupunguza utegemezi wa uboreshaji wa ioni ya magnesiamu, Platinum Taq DNA polymerase inaweza kutumika.Platinamu Taq DNA polymerase inaweza kudumisha utendakazi juu ya anuwai pana ya viwango vya ioni ya magnesiamu kuliko polymerase ya Taq DNA na kwa hivyo inahitaji uboreshaji mdogo.
9. Viongezeo vya kukuza Pcr
Uboreshaji wa halijoto ya kupenyeza, muundo wa kwanza na ukolezi wa ioni ya magnesiamu inatosha kwa ukuzaji mahususi wa violezo vingi;hata hivyo, baadhi ya violezo, ikiwa ni pamoja na zile zilizo na maudhui ya juu ya GC, zinahitaji hatua za ziada.Viungio vinavyoathiri halijoto ya kuyeyuka kwa DNA hutoa njia nyingine ya kuboresha ubora wa bidhaa na mavuno.Denaturation kamili ya kiolezo inahitajika kwa matokeo bora.
Kwa kuongeza, muundo wa sekondari huzuia kumfunga kwa primer na ugani wa enzyme.
Viungio vya PCR, ikiwa ni pamoja na formamide, DMSO, glycerin, betaine, na Suluhisho la PCRx Enhancer, huongeza ukuzaji.Utaratibu wao unaowezekana ni kupunguza halijoto ya kuyeyuka, na hivyo kusaidia uwekaji wa viambatisho na kusaidia upanuzi wa DNA polymerase kupitia eneo la muundo wa pili.Suluhisho la PCRx lina faida zingine.Uboreshaji mdogo wa ioni ya magnesiamu inahitajika unapotumiwa na Platinum Taq DNA polymerase na Platinum Pfx DNA polymerase.Kwa hivyo, mbinu ya Platinamu imejumuishwa na nyongeza ya kuongeza utaalam huku ikipunguza utegemezi wa mbinu ya tatu, uboreshaji wa ioni ya magnesiamu.Kwa matokeo bora zaidi, mkusanyiko wa viungio unapaswa kuboreshwa, hasa DMSO, formamide, na glycerol, ambayo huzuia Taq DNA polymerase.
10. Kuanza kwa moto
PCR ya kuanza moto ni mojawapo ya mbinu muhimu zaidi za kuboresha umaalum wa PCR pamoja na muundo mzuri wa kitangulizi.Ingawa halijoto mojawapo ya kurefusha urefu wa polimerasi ya Taq DNA ni 72℃, polima husalia amilifu kwenye joto la kawaida.Kwa hivyo, bidhaa zisizo maalum zinazalishwa wakati joto la kushikilia ni la chini kuliko joto la annealing wakati wa maandalizi ya mmenyuko wa PCR na mwanzoni mwa mzunguko wa joto.Baada ya kuunda, bidhaa hizi zisizo maalum huimarishwa kwa ufanisi.PCR ya kuanza-moto ni nzuri hasa tovuti zinazotumiwa kwa usanifu wa kianzilishi zinadhibitiwa na eneo la vipengele vya kijenetiki, kama vile mabadiliko yanayoelekezwa kwenye tovuti, uundaji wa msemo, au ujenzi na upotoshaji wa chembe za urithi zinazotumika kwa uhandisi wa DNA.
Njia ya kawaida ya kupunguza shughuli ya Taq DNA polymerase ni kuandaa suluhisho la majibu ya PCR kwenye barafu na kuiweka kwenye kifaa cha PCR kilichopashwa joto.Njia hii ni rahisi na ya gharama nafuu, lakini haina kukamilisha shughuli ya enzyme na kwa hiyo haina kuondoa kabisa amplification ya bidhaa zisizo maalum.
Uanzishaji wa mafuta huchelewesha usanisi wa DNA kwa kuzuia kijenzi muhimu hadi kifaa cha PCR kifikie halijoto ya denaturation.Mbinu nyingi za uanzishaji wa mafuta kwa mikono, ikijumuisha kuchelewa kuongezwa kwa polimerasi ya Taq DNA, ni ngumu, haswa kwa matumizi ya matokeo ya juu.Mbinu zingine za uwekaji mafuta hutumia ngao ya nta kuambatanisha kijenzi muhimu, ikiwa ni pamoja na ioni za magnesiamu au vimeng'enya, au kutenganisha vipengele tendaji, kama vile violezo na vihifadhi.Wakati wa mzunguko wa joto, vipengele mbalimbali hutolewa na kuchanganywa pamoja kama nta inayeyuka.Kama njia ya mwongozo ya kuanza moto, mbinu ya ngao ya nta ni ngumu na inakabiliwa na uchafuzi na haifai kwa matumizi ya juu ya upitishaji.
Platinamu DNA polymerase ni rahisi na bora kwa PCR ya kuanza moto kiotomatiki.Platinum Taq DNA polimasi inajumuisha recombinant Taq DNA polymerase pamoja na kingamwili monokloni dhidi ya Taq DNA polymerase.Kingamwili huundwa na PCR ili kuzuia shughuli ya kimeng'enya wakati wa kushikilia joto kwa muda mrefu.Taq DNA polima ilitolewa kwenye mmenyuko wakati wa insulation ya 94℃ ya hatua ya denaturation, kurejesha shughuli kamili ya polimerasi.Kinyume na polimerasi ya Taq DNA iliyorekebishwa kwa kemikali kwa ajili ya kuanzishwa kwa joto, kimeng'enya cha Platinamu hahitaji insulation ya muda mrefu ya 94℃ (dakika 10 hadi 15) ili kuwezesha polimasi.Kwa PlatinumTaq DNA polymerase, 90% ya shughuli ya Taq DNA polymerase ilirejeshwa baada ya dakika 2 katika 94 ℃.
Njia rahisi ya HS Taq DNA Polymerase
11. Nest-PCR
Mizunguko mfululizo ya ukuzaji kwa kutumia vianzio vilivyowekwa kwenye kiota inaweza kuboresha umaalum na usikivu.Mzunguko wa kwanza ni ukuzaji wa kawaida wa mizunguko 15 hadi 20.Sehemu ndogo ya bidhaa ya awali ya ukuzaji ilipunguzwa mara 100 hadi 1000 na kuongezwa kwa mzunguko wa pili wa ukuzaji kwa mizunguko 15 hadi 20.Vinginevyo, bidhaa ya awali iliyoimarishwa inaweza kuwa ukubwa na utakaso wa gel.Kitangulizi kilichowekwa kiota hutumiwa katika duru ya pili ya ukuzaji, ambayo inaweza kushikamana na mlolongo wa lengo ndani ya primer ya kwanza.Matumizi ya PCR iliyoorodheshwa hupunguza uwezekano wa ukuzaji wa tovuti nyingi lengwa kwa sababu kuna mifuatano michache lengwa inayosaidiana na seti zote mbili za vianzio.Idadi sawa ya mizunguko (30 hadi 40) iliyo na vianzio sawa ilikuza tovuti zisizo maalum.PCR Nested huongeza usikivu wa mpangilio mdogo wa lengo (km, mrna adimu) na kuboresha umaalum wa PCRS ngumu (km 5′ RACE).
12. Kushuka kwa PCR
Kushuka kwa PCR huboresha umaalumu kwa kutumia masharti magumu ya kufunga kwa mizunguko michache ya kwanza ya PCR.Mzunguko huanza kwa halijoto ya annealing takriban 5℃ juu kuliko Tm inayokadiriwa, kisha kila mzunguko hupunguzwa kwa 1℃ hadi 2℃ hadi halijoto ya kuchubua iwe chini ya Tm 5℃.Kiolezo lengwa pekee chenye homolojia ya juu zaidi ndicho kitakuzwa.Bidhaa hizi zinaendelea kupanuka katika mizunguko inayofuata, zikileta bidhaa zisizo maalum.Kushuka kwa PCR ni muhimu kwa mbinu ambapo kiwango cha homolojia kati ya kiolezo cha msingi na kiolezo lengwa hakijulikani, kama vile alama za vidole za AFLP DNA.
Vifaa vya PCR vinavyohusiana
Shujaa wa 2× PCRTMMfumo wa Mchanganyiko una uwezo wa juu wa kustahimili vizuizi vya PCR kuliko mfumo wa kawaida wa Mchanganyiko wa PCR, na unaweza kukabiliana kwa urahisi na ukuzaji wa PCR wa violezo mbalimbali changamano.Mfumo wa kipekee wa athari na Taq Hero wa ufanisi wa juu hufanya mmenyuko wa PCR kuwa na ufanisi wa juu wa ukuzaji, umaalumu na usikivu.
Ufanisi wa juu wa amplification
Ina 5'→3' DNA polymerase shughuli na 5'→3' exonuclease shughuli, bila 3'→5' shughuli exonuclease.
Wakati Halisi PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Maalum—bafa iliyoboreshwa na kimeng’enya cha Taq cha kuanza moto kinaweza kuzuia ukuzaji usio maalum na uundaji wa kipenyo cha kwanza.
Usikivu wa juu-unaweza kugundua nakala za chini za kiolezo
Seti hii hutumia kitendanishi cha kipekee cha unukuzi cha Foregene reverse na Foregene HotStar Taq DNA Polymerase pamoja na mfumo wa kipekee wa maitikio ili kuboresha ufanisi wa ukuzaji na umahususi wa maitikio.
Muda wa kutuma: Mei-09-2023
