• PCR ni njia inayotumiwa kukuza DNA kutoka kwa kiasi kidogo cha kiolezo cha DNA.RT-PCR hutumia unukuzi wa kinyume ili kutoa kiolezo cha DNA kutoka chanzo cha RNA ambacho kinaweza kukuzwa.
• PCR na RT-PCR kwa kawaida ni miitikio ya mwisho, ilhali qPCR na RT-qPCR hutumia kinetiki za kiwango cha usanisi wa bidhaa wakati wa maitikio ya PCR ili kuhesabu kiasi cha kiolezo kilichopo.
• Mbinu mpya zaidi, kama vile PCR ya kidijitali, hutoa kiasi kamili cha kiolezo cha awali cha DNA, ilhali mbinu kama vile PCR ya isothermal hupunguza hitaji la vifaa vya gharama kubwa ili kutoa matokeo ya kuaminika.

Polymerase chain reaction (PCR) ni mbinu rahisi na inayotumika sana ya baiolojia ya molekuli kukuza na kugundua mfuatano wa DNA na RNA.Ikilinganishwa na mbinu za kitamaduni za upangaji na ukuzaji wa DNA, ambayo mara nyingi inaweza kuchukua siku, PCR inahitaji saa chache tu.PCR ni nyeti sana na inahitaji kiolezo kidogo ili kutambua na kukuza mfuatano mahususi.Mbinu za msingi za PCR zimeendelea zaidi kutoka kwa utambuzi rahisi wa DNA na RNA.Hapa chini, tumetoa muhtasari wa mbinu tofauti za PCR na vitendanishi tunachotoa katika Enzo Life Sciences kwa mahitaji yako ya utafiti.Tunalenga kuwasaidia wanasayansi kufikia kwa haraka vitendanishi vya PCR ili kutumia katika mradi wao unaofuata wa utafiti!

PCR

Kwa PCR ya kawaida, unachohitaji ni DNA polimasi, magnesiamu, nyukleotidi, vianzio, kiolezo cha DNA cha kukuzwa na kidhibiti joto.Utaratibu wa PCR ni rahisi kama kusudi lake: 1) DNA yenye nyuzi mbili (dsDNA) imebadilishwa joto, 2) vianzio vinalingana na nyuzi moja ya DNA, na 3) vianzio vinapanuliwa na DNA polymerase, na kusababisha nakala mbili za safu ya asili ya DNA.Mchakato wa kubadilisha, kurefusha, na kurefusha kwa mfululizo wa halijoto na nyakati unajulikana kama mzunguko mmoja wa ukuzaji (Mchoro 1).

Kila hatua ya mzunguko inapaswa kuboreshwa kwa kiolezo na seti ya primer inayotumiwa.Mzunguko huu unarudiwa takriban mara 20-40, na bidhaa iliyoimarishwa inaweza kuchambuliwa, kwa kawaida na gel ya agarose (Mchoro 2).

Kwa kuwa PCR ni njia nyeti sana na ujazo mdogo sana unahitajika kwa athari moja, utayarishaji wa mchanganyiko mkuu kwa athari kadhaa unapendekezwa.Mchanganyiko mkuu lazima uchanganywe vizuri na kisha ugawanywe kwa idadi ya athari, kuhakikisha kwamba kila mmenyuko utakuwa na kiwango sawa cha kimeng'enya, dNTP na vianzio.Watoa huduma wengi, kama vile Enzo Life Sciences, pia hutoa mchanganyiko wa PCR ambao tayari una kila kitu isipokuwa vitangulizi na kiolezo cha DNA.

Maeneo ya Guanine/Cytosine-tajiri (GC-tajiri) yanawakilisha changamoto katika mbinu za kawaida za PCR.Mifuatano yenye utajiri wa GC ni thabiti zaidi kuliko mifuatano yenye maudhui ya chini ya GC.Zaidi ya hayo, mfuatano wa GC-tajiri huwa na kuunda miundo ya pili, kama vile loops za hairpin.Kama matokeo, nyuzi mbili zenye utajiri wa GC ni ngumu kutenganisha kabisa wakati wa awamu ya denaturation.Kwa hivyo, polima ya DNA haiwezi kuunganisha uzi mpya bila kizuizi.Halijoto ya juu zaidi ya urejeshaji inaweza kuboresha hali hii, na marekebisho kuelekea halijoto ya juu ya annealing na muda mfupi wa kupenyeza unaweza kuzuia ufungaji usio maalum wa viasili vya GC-tajiri.Vitendanishi vya ziada vinaweza kuimarisha upanuzi wa mfuatano wa utajiri wa GC.DMSO, glycerol, na betaine husaidia kuvuruga miundo ya pili ambayo husababishwa na mwingiliano wa GC na hivyo kuwezesha utengano wa nyuzi mbili.

Moto Anza PCR

Ukuzaji usio maalum ni tatizo ambalo linaweza kutokea wakati wa PCR.Polima nyingi za DNA ambazo hutumiwa kwa PCR hufanya kazi vizuri zaidi katika halijoto karibu 68°C hadi 72°C.Hata hivyo, kimeng'enya kinaweza kufanya kazi kwa joto la chini, ingawa kwa kiwango cha chini.Katika halijoto iliyo chini sana ya halijoto ya kupitishia hewa, vianzio vinaweza kushikamana visivyo mahususi na kusababisha ukuzaji usio mahususi, hata kama majibu yamewekwa kwenye barafu.Hili linaweza kuzuiwa kwa kutumia vizuizi vya polimerasi ambavyo hujitenga na polimerasi ya DNA mara tu halijoto fulani inapofikiwa, hivyo basi neno moto kuanza PCR.Kizuizi kinaweza kuwa kingamwili inayofunga polimasi na chembechembe kwenye joto la awali la uasilia (95°C kawaida).

Polymerase ya Uaminifu wa Juu

Ingawa polima za DNA hukuza kwa usahihi kwa mfuatano wa violezo asilia, makosa katika ulinganishaji wa nyukleotidi yanaweza kutokea.Kutolingana katika programu kama vile uundaji wa cloning kunaweza kusababisha manukuu yaliyopunguzwa, na protini zilizotafsiriwa vibaya au zisizotumika chini ya mkondo.Ili kuepuka ulinganifu huu, polima zilizo na shughuli ya "kusahihisha" zimetambuliwa na kuingizwa kwenye mtiririko wa kazi.Polimasa ya kwanza ya kusahihisha, Pfu, ilitambuliwa mnamo 1991 huko Pyrococcus furiosus.Kimeng'enya hiki cha Pfu kina shughuli ya exonuclease ya 3' hadi 5'.DNA inapokuzwa, exonuclease huondoa nukleotidi zisizolingana kwenye mwisho wa 3' wa uzi.Nucleotide sahihi basi inabadilishwa, na usanisi wa DNA unaendelea.Utambulisho wa mfuatano usio sahihi wa nyukleotidi unatokana na mshikamano unaofunga kwa nucleoside trifosfati sahihi na kimeng'enya, ambapo ufungaji usiofaa hupunguza usanisi na kuruhusu uingizwaji sahihi.Shughuli ya kusahihisha ya polimerasi ya Pfu husababisha makosa machache katika mfuatano wa mwisho ikilinganishwa na polimasi ya Taq DNA.Katika miaka ya hivi karibuni, vimeng'enya vingine vya kusahihisha vimetambuliwa, na marekebisho ya kimeng'enya asilia ya Pfu yamefanywa ili kupunguza zaidi kiwango cha makosa wakati wa ukuzaji wa DNA.

RT-PCR

Reverse transcription PCR, au RT-PCR, inaruhusu matumizi ya RNA kama kiolezo.Hatua ya ziada inaruhusu kugundua na kukuza RNA.RNA imenakiliwa kinyume hadi DNA ya ziada (cDNA), kwa kutumia reverse transcriptase.Ubora na usafi wa kiolezo cha RNA ni muhimu kwa mafanikio ya RT-PCR.Hatua ya kwanza ya RT-PCR ni usanisi wa mseto wa DNA/RNA.Reverse transcriptase pia ina kazi ya RNase H, ambayo huharibu sehemu ya RNA ya mseto.Kisha molekuli ya DNA yenye ncha moja inakamilishwa na shughuli ya DNA polymerase inayotegemea DNA ya nakala ya kinyume kuwa cDNA.Ufanisi wa mmenyuko wa kwanza-strand unaweza kuathiri mchakato wa amplification.Kuanzia hapa na kuendelea, utaratibu wa kawaida wa PCR unatumika kukuza cDNA.Uwezekano wa kurejesha RNA kuwa cDNA na RT-PCR una faida nyingi, na kimsingi hutumiwa kwa uchanganuzi wa usemi wa jeni.RNA ina mshororo mmoja na haina msimamo, ambayo inafanya kuwa changamoto kufanya kazi nayo.Kwa kawaida hutumika kama hatua ya kwanza katika qPCR, ambayo hubainisha nakala za RNA katika sampuli ya kibayolojia.

qPCR na RT-qPCR

Kiasi cha PCR (qPCR) hutumika kugundua, kubainisha na kukadiria asidi nukleiki kwa matumizi mengi.Katika RT-qPCR, nakala za RNA mara nyingi hutambulishwa kwa kuzibadilisha kuwa cDNA kwanza, kama ilivyoelezwa hapo juu, na kisha qPCR inatekelezwa.Kama ilivyo katika PCR ya kawaida, DNA huimarishwa kwa hatua tatu zinazojirudia: denaturation, annealing, na elongation.Hata hivyo, katika qPCR, uwekaji lebo za umeme huwezesha ukusanyaji wa data kadiri PCR inavyoendelea.Mbinu hii ina faida nyingi kutokana na anuwai ya mbinu na kemia zinazopatikana.

Katika qPCR inayotokana na rangi (kwa kawaida ya kijani), uwekaji alama wa umeme huruhusu ukadiriaji wa molekuli za DNA zilizokuzwa kwa kutumia matumizi ya rangi ya dsDNA.Wakati wa kila mzunguko, fluorescence hupimwa.Ishara ya fluorescence huongezeka sawia na kiasi cha DNA iliyoiga.Kwa hiyo, DNA inahesabiwa kwa "muda halisi" (Mchoro 3).Hasara za qPCR inayotokana na rangi ni kwamba lengo moja pekee linaweza kuchunguzwa kwa wakati mmoja na kwamba rangi itaunganishwa na ds-DNA yoyote iliyopo kwenye sampuli.

Katika qPCR kulingana na uchunguzi, shabaha nyingi zinaweza kutambuliwa kwa wakati mmoja katika kila sampuli, lakini hii inahitaji uboreshaji na muundo wa uchunguzi maalum unaolengwa unaotumika pamoja na vianzio.Aina kadhaa za miundo ya uchunguzi zinapatikana, lakini aina ya kawaida ni uchunguzi wa hidrolisisi, ambayo inajumuisha fluorophore na quencher.Uhamisho wa nishati ya resonance ya Fluorescence (FRET) huzuia utoaji wa fluorophore kupitia kizima moto huku uchunguzi ukiwa mzima.Hata hivyo, wakati wa majibu ya PCR, probe ni hidrolisisi wakati wa ugani wa primer na amplification ya mlolongo maalum ni amefungwa.Mgawanyiko wa probe hutenganisha fluorophore kutoka kwa quencher na husababisha ongezeko la tegemezi la amplification katika fluorescence (Mchoro 4).Kwa hivyo, mawimbi ya umeme kutoka kwa mmenyuko wa qPCR unaotegemea uchunguzi ni sawia na kiasi cha mfuatano wa lengo la uchunguzi uliopo kwenye sampuli.Kwa sababu qPCR inayotegemea uchunguzi ni mahususi zaidi kuliko qPCR inayotokana na rangi, mara nyingi ndiyo teknolojia inayotumiwa katika majaribio ya uchunguzi ya msingi wa qPCR.

Ukuzaji wa Isothermal

Mbinu za PCR zilizotajwa hapo juu zinahitaji vifaa vya gharama ya juu vya urekebishaji joto-joto ili kuongeza na kushuka kwa usahihi halijoto ya chumba kwa hatua za urekebishaji, uwekaji hewa na upanuzi.Mbinu kadhaa zimetengenezwa ambazo haziitaji vifaa sahihi na zinaweza kufanywa katika umwagaji rahisi wa maji au hata ndani ya seli za kupendeza.Mbinu hizi kwa pamoja zinaitwa ukuzaji wa isothermal na hufanya kazi kulingana na ukuzaji wa kipeo, mstari au mteremko.

Aina inayojulikana zaidi ya ukuzaji wa isothermal ni ukuzaji wa isothermal unaoingiliana na kitanzi, au LAMP.LAMP hutumia ukuzaji wa kielelezo katika 65⁰C kukuza kiolezo cha DNA au RNA.Wakati wa kufanya LAMP, vianzio vinne hadi sita vinavyosaidiana na maeneo ya DNA inayolengwa hutumiwa na polimerasi ya DNA kuunganisha DNA mpya.Mbili kati ya viasili hivi vina mfuatano wa ziada ambao hutambua mfuatano katika vianzio vingine na kuvifunga, hivyo kuruhusu muundo wa "kitanzi" kuunda katika DNA iliyosanisishwa upya ambayo kisha inasaidia uwekaji wa utangulizi katika duru zinazofuata za ukuzaji.TAA inaweza kuonekana kwa njia nyingi, ikiwa ni pamoja na fluorescence, agarose gel electrophoresis, au colorimetry.Urahisi wa kuibua na kugundua uwepo au kutokuwepo kwa bidhaa kwa rangi na ukosefu wa vifaa vya gharama kubwa vinavyohitajika kulifanya LAMP kuwa chaguo linalofaa kwa uchunguzi wa SARS-CoV-2 katika maeneo ambayo majaribio ya maabara ya kliniki hayakupatikana kwa urahisi, au uhifadhi na usafirishaji wa sampuli. haikuwezekana, au katika maabara ambazo hapo awali hazikuwa na vifaa vya kupima joto vya PCR.