Nakala za kawaida za reverse haziwezi kustahimili joto la juu (joto mojawapo kwa shughuli ya MMLV ni 37-50°C, na AMV ni 42-60°C).RNA ya virusi ngumu zaidi haiwezi kubadilishwa kwa ufanisi katika cDNA katika halijoto ya chini, na hivyo kusababisha ufanisi wa ugunduzi Kupunguza.RT-qPCR ya jadi kwa ujumla inahitaji ushiriki wa vimeng'enya viwili muhimu (reverse transcriptase na DNA polymerase), ambayo inafanya kuwa vigumu kurahisisha utendakazi wa mfumo wa mmenyuko na kupunguza gharama.Hapa tutaanzisha nakala mbili za kinyume zinazostahimili halijoto ya juu, TTH na RevTaq.Vimeng'enya hivi viwili pia vina kazi ya DNA polymerase, hivyo huitwa vimeng'enya visivyofanya kazi.

TH DNA polymerase

Lazima uwe umesikia kuhusu TH, ambayo inatokana na bakteria ya thermophilic Thermus thermophilus HB8.Katika uwepo wa cations divalent kama vile Mg2+, ina DNA polymerase shughuli.Inatumika sana katika miitikio ya PCR kama kimeng'enya cha Taq, lakini ina upinzani wa juu wa joto kuliko kimeng'enya cha Taq, kwa hivyo ina athari bora kwa PCR yenye violezo vya juu vya maudhui ya GC.

· Kimeng'enya hiki kimsingi hakina shughuli ya 3′→5′ exonuclease na 5′→3′ exonuclease, kwa hivyo kinaweza pia kutumika kwa mpangilio wa dideoxy.

Kimeng'enya hiki kina shughuli ya RTase.Kwa uwepo wa Mn2+, shughuli ya RTase itaimarishwa.Kwa kutumia kipengele hiki, inaweza kutumika kutekeleza maitikio ya unukuzi wa kinyume na athari ya PCR katika tyubu sawa, yaani, RT-PCR ya hatua moja.Hata hivyo, mbele ya Mn2 +, usahihi wa RT-PCR sio juu.Shughuli ya RT haina uhusiano wowote na shughuli ya rnaase H.

· Kuongezeka kwa shughuli ya Tth-DNA polymerase (pH9, optimum +55℃～+70℃, upeo +95℃) hushinda matatizo yanayosababishwa na muundo wa pili wa RNA.cDNA inayotokana inaweza kukuzwa na PCR kwa kimeng'enya sawa mbele ya ioni za Mg2+.

· Uwezo wa Tth-DNA polymerase kufanya unukuzi wa kinyume na ukuzaji wa DNA katika viwango vya joto vya juu hufanya kimeng'enya hiki kuwa muhimu kwa uchanganuzi wa kiasi cha RT-PCR, uunganishaji, na usemi wa jeni wa RNA ya seli na virusi.
· Tth-DNA polymerase hutumiwa kwa RT-PCR kukuza RNA hadi 1kb.

Vipengele na faida

Tth DNA polymerase:

• Hakikisha ukubwa wa bidhaa ulioboreshwa wa polymerase chain reaction (PCR), angalau 1000 bp katika maitikio ya RT-PCR

• Kubali deoxyribonucleoside trifosfati iliyorekebishwa kama sehemu ndogo

• Haihusiani na shughuli ya RNase H

• Ina uthabiti wa juu wa mafuta ili kushinda matatizo, kwa kawaida huhusiana na muundo wa juu wa upili uliopo katika RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

DNA polimasi inayostahimili joto na shughuli ya reverse transcriptase

RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase ni kimeng'enya kilichobuniwa, kinachostahimili joto sana, kinachofanya kazi mara mbili na shughuli za reverse transcriptase na DNA polymerase zinazopatikana kupitia mageuzi yaliyoelekezwa na ya bandia.

· Nusu ya maisha ya RevTaq RT-PCR DNA polymerase katika 95°C ni zaidi ya dakika 40.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase inaruhusu unukuzi wa kinyume cha halijoto ya juu moja kwa moja kutoka kwa kiolezo cha RNA, na hatua ya unukuzi wa kinyume inaweza kurudiwa mara nyingi ili kutoa violezo vingi vya cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase inaruhusu "hatua sifuri" RT-PCR (hakuna hatua ya unukuzi wa kinyume cha isothermal), kwa sababu katika hatua ya mzunguko wa PCR ya upanuzi, unukuzi wa kinyume na ukuzaji wa DNA hutokea kwa wakati mmoja.Hii pia inakuza athari ya unukuzi kinyume katika halijoto ya juu, na hivyo kupunguza matatizo yanayojitokeza katika kuyeyusha muundo dhabiti wa unukuzi katika RNA katika halijoto ya juu.

· Kutokana na fomula ya aptamer-based hot-start, RevTaq RT-PCR DNA polymerase itatoa matokeo bora wakati halijoto ya kunyonya na kuongeza joto ni kubwa kuliko 57°C.

· Kwa kuwa kimeng’enya kinastahimili joto, inashauriwa kutengeneza vianzio na vichunguzi vyenye viwango vya juu sana vya kuyeyuka (>60°C).

· Inapendekezwa kuboresha halijoto ya hatua ya upunguzaji/upanuzi kupitia kipenyo cha halijoto wakati wa mchakato wa kuweka majibu.

· Kadiri halijoto inavyoongezeka, ndivyo utaalam wa PCR unavyoongezeka.Mzunguko wa unukuu wa kinyume kawaida hufanywa kwa halijoto ya juu zaidi kuliko mzunguko wa PCR, kwa sababu mseto wa Kiolezo cha DNA:RNA Template huwa na kiwango cha juu cha kuyeyuka kuliko DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase imeundwa kijeni na kuboreshwa, na ukubwa wa amplikoni ni kati ya 60-300 bp.

Kikomo cha kugundua polymerase ya RevTaq RT-PCR DNA kinafikia nakala 4 /

Mfumo wa mmenyuko ulioboreshwa (uanzishwaji wa primers za kiwango cha juu cha kuyeyuka) umeonyeshwa kwenye takwimu.RevTaq RT-PCR DNA polymerase-driven RT-PCR inaonyesha unyeti bora kuliko mchanganyiko mkuu wa RT-qPCR wa hatua 1 wa TaqPath, na ugunduzi wa chini wa Sampuli ya upinde rangi ya dilution.

Faida zaidi:

Kitendaji cha kuanza kwa haraka → Hatua ya awali ya kubadilika kwa mafuta inaweza kurukwa.

Fomula ya aptamer ya kuanza-moto → Toa 100% ya shughuli ya kimeng'enya mara moja na uzuie ukuzaji usio mahususi kwa halijoto ya chini (<57°C).

Utendakazi wa upenyezaji → Hatua ya uchimbaji wa RNA imeachwa, kwa sababu polimerasi ya RevTaq RT-PCR DNA pia inaweza kuchakata sampuli za majibu ghafi.Inaweza kuharibu mara moja utando wa seli za yukariyoti, bakteria na virusi katika mzunguko wa moto wa RT-PCR.

Kiwango cha malighafi ya IVD → viwango vya ubora wa juu na bei za ushindani sana