1. Maarifa ya kimsingi (ikiwa unataka kuona sehemu ya majaribio, tafadhali hamishia moja kwa moja hadi sehemu ya pili)
Kama matokeo ya PCR ya kawaida, PCR ya Wakati Halisi hufuatilia hasa mabadiliko ya kiasi cha bidhaa ya ukuzaji katika kila mzunguko wa mmenyuko wa ukuzaji wa PCR kwa wakati halisi kupitia badiliko la mawimbi ya umeme, na kuchanganua kwa kiasi kiolezo cha kuanzia kupitia uhusiano kati ya thamani ya ct na curve ya kawaida .
Data maalum ya RT-PCR nimsingi, kizingiti cha fluorescencenathamani ya Ct.
| msingi: | Thamani ya fluorescence ya mzunguko wa 3-15 ni msingi (msingi), unaosababishwa na makosa ya mara kwa mara ya kipimo. |
| Kizingiti (kizingiti): | Inarejelea kikomo cha ugunduzi wa umeme kilichowekwa katika nafasi ifaayo katika eneo la ukuaji wa kipeo cha mkunjo wa mkunjo, kwa ujumla mara 10 ya mkengeuko wa kawaida wa msingi. |
| Thamani ya CT: | Ni idadi ya mizunguko ya PCR wakati thamani ya fluorescence katika kila bomba la majibu inafikia kizingiti. Thamani ya Ct inawiana kinyume na kiasi cha kiolezo cha awali. |
Njia za kawaida za kuweka lebo za RT-PCR:
| njia | faida | upungufu | wigo wa maombi |
| SYBR KijaniⅠ | Inatumika kwa upana, nyeti, nafuu na rahisi | Mahitaji ya primer ni ya juu, yanakabiliwa na bendi zisizo maalum | Inafaa kwa uchanganuzi wa kiasi cha jeni mbalimbali zinazolengwa, utafiti juu ya usemi wa jeni, na utafiti kuhusu wanyama na mimea inayobadilika badilika. |
| TaqMan | Umaalumu mzuri na kurudiwa kwa hali ya juu | Bei ni ya juu na inafaa tu kwa malengo maalum. | Ugunduzi wa pathojeni, utafiti wa jeni zinazokinza dawa, tathmini ya ufanisi wa dawa, utambuzi wa magonjwa ya kijeni. |
| taa ya molekuli | Umaalumu wa juu, fluorescence, background ya chini | Bei ni ya juu, inafaa tu kwa madhumuni maalum, kubuni ni vigumu, na bei ni ya juu. | Uchambuzi wa jeni maalum, uchambuzi wa SNP |
2. Hatua za majaribio
2.1 Kuhusu kikundi cha majaribio- lazima kuwe na visima vingi katika kikundi, na lazima kuwe na marudio ya kibaiolojia.
| ① | Udhibiti tupu | Hutumika kutambua hali ya ukuaji wa seli katika majaribio |
| ② | Udhibiti hasi siRNA (mfuatano usio maalum wa siRNA) | Onyesha umaalumu wa kitendo cha RNAi.siRNA inaweza kushawishi mwitikio usio maalum wa dhiki katika mkusanyiko wa 200nM. |
| ③ | Udhibiti wa Reagent ya Uhamisho | Usijumuishe sumu ya kitendanishi cha uambukizaji kwa seli au athari kwenye usemi wa jeni lengwa |
| ④ | siRNA dhidi ya jeni lengwa | Piga chini usemi wa jeni lengwa |
| ⑤ (si lazima) | siRNA chanya | Inatumika kutatua matatizo ya mfumo wa majaribio na uendeshaji |
| ⑥ (si lazima) | Udhibiti wa fluorescent siRNA | Ufanisi wa uhamishaji wa seli unaweza kuzingatiwa na darubini |
2.2 Kanuni za muundo wa primer
| Ukubwa wa kipande kilichoimarishwa | Ikiwezekana kwa 100-150bp |
| Urefu wa Primer | 18-25bp |
| Maudhui ya GC | 30% -70%, ikiwezekana 45% -55% |
| thamani ya Tm | 58-60 ℃ |
| Mfuatano | Epuka T / C kuendelea;A/G kuendelea |
| 3 mwisho mlolongo | Epuka GC tajiri au AT tajiri;msingi wa terminal ni vyema G au C;ni bora kuepuka T |
| Kukamilishana | Epuka mifuatano inayosaidiana ya besi zaidi ya 3 ndani ya kitangulizi au kati ya vianzio viwili |
| Umaalumu | Tumia utafutaji wa mlipuko ili kuthibitisha umaalum wa kwanza |
①SiRNA ni spishi mahususi, na mfuatano wa spishi tofauti utakuwa tofauti.
②SiRNA imewekwa kwenye poda iliyokaushwa kwa kuganda, ambayo inaweza kuhifadhiwa kwa utulivu kwa wiki 2-4 kwenye joto la kawaida.
2.3 Zana au vitendanishi vinavyohitaji kutayarishwa mapema
| Primer (rejeleo la ndani) | Ikiwa ni pamoja na mbele na nyuma mbili |
| Primers (jini lengwa) | Ikiwa ni pamoja na mbele na nyuma mbili |
| Lengo Si RNA (vipande 3) | Kwa ujumla, kampuni itaunganisha vipande 3, na kisha kuchagua moja ya tatu kwa RT-PCR |
| Seti ya Uhamisho | Lipo2000 nk. |
| Seti ya uchimbaji wa haraka wa RNA | Kwa uchimbaji wa RNA baada ya kuambukizwa |
| Seti ya Unukuzi wa Urejeshaji wa Haraka | kwa usanisi wa cDNA |
| Seti ya ukuzaji wa PCR | 2×Super SYBR Kijani Mchanganyiko Mkuu wa qPCR |
2.4 Kuhusu masuala yanayohitaji kuzingatiwa katika hatua mahususi za majaribio:
① mchakato wa uhamishaji wa siRNA
1. Kwa upako, unaweza kuchagua sahani yenye visima 24, sahani ya visima 12 au sahani 6 (wastani wa mkusanyiko wa RNA unaopendekezwa katika kila kisima cha sahani yenye visima 24 ni takriban 100-300 ng/uL), na msongamano bora wa seli ni hadi 60 % -80% au hivyo.
2. Hatua za uhamisho na mahitaji maalum ni madhubuti kulingana na maagizo.
3. Baada ya kuambukizwa, sampuli zinaweza kukusanywa ndani ya saa 24-72 ili kugundua mRNA (RT-PCR) au kugundua protini ndani ya saa 48-96 (WB)
② Mchakato wa uchimbaji wa RNA
1. Zuia uchafuzi wa vimeng'enya vya nje.Hasa ni pamoja na kuvaa masks na kinga madhubuti;kutumia vidokezo vya pipette iliyokatwa na zilizopo za EP;maji yaliyotumika katika jaribio lazima yasiwe na RNase.
2. Inashauriwa kufanya mara mbili kama inavyopendekezwa katika kit ya uchimbaji wa haraka, ambayo itaboresha kweli usafi na mavuno.
3. Kioevu cha taka haipaswi kugusa safu ya RNA.
③ Ukadiriaji wa RNA
Baada ya RNA kutolewa, inaweza kuhesabiwa moja kwa moja na Nanodrop , na kiwango cha chini cha usomaji kinaweza kuwa cha chini kama 10ng/ul.
④Batilisha mchakato wa unukuzi
1. Kutokana na unyeti wa juu wa RT-qPCR, angalau visima 3 sambamba vinapaswa kufanywa kwa kila sampuli ili kuzuia Ct inayofuata kutoka kuwa tofauti sana au SD kuwa kubwa sana kwa uchanganuzi wa takwimu.
2. Usifungie na kuyeyusha mchanganyiko wa Mwalimu mara kwa mara.
3. Kila bomba/shimo lazima libadilishwe na ncha mpya!Usitumie kidokezo sawa cha pipette ili kuongeza sampuli!
4. Filamu iliyounganishwa kwenye sahani ya visima 96 baada ya kuongeza sampuli inahitaji kulainisha na sahani.Ni bora kwa centrifuge kabla ya kuiweka kwenye mashine, ili kioevu kwenye ukuta wa tube inaweza kutiririka chini na kuondoa Bubbles hewa.
⑤Uchambuzi wa kawaida wa curve
| Hakuna kipindi cha ukuaji wa logarithmic | Uwezekano mkubwa wa mkusanyiko wa kiolezo |
| Hakuna thamani ya CT | Hatua zisizo sahihi za kugundua ishara za fluorescent; uharibifu wa primers au probes - uadilifu wake unaweza kugunduliwa na electrophoresis ya PAGE; kiasi cha kutosha cha template; uharibifu wa templates - kuepuka kuanzishwa kwa uchafu na kufungia mara kwa mara na kufuta katika maandalizi ya sampuli; |
| Kt>38 | Ufanisi wa chini wa amplification;Bidhaa ya PCR ni ndefu sana;vipengele mbalimbali vya majibu vinaharibiwa |
| Mkondo wa ukuzaji wa mstari | Uchunguzi unaweza kuharibiwa kwa mizunguko ya kurudia ya kufungia au kuangaziwa kwa muda mrefu. |
| Tofauti katika shimo mbili ni kubwa sana | Suluhisho la majibu halijayeyuka kabisa au suluhisho la majibu halijachanganywa;umwagaji wa joto wa chombo cha PCR huchafuliwa na vitu vya fluorescent |
2.5 Kuhusu uchambuzi wa data
Uchambuzi wa data wa qPCR unaweza kugawanywa katika ukadiriaji jamaa na ukadiriaji kamili.Kwa mfano, seli katika kikundi cha matibabu ikilinganishwa na seli kwenye kikundi cha kudhibiti,
Ni mara ngapi mRNA ya jeni X inabadilika, hii ni quantification ya jamaa;katika idadi fulani ya seli, mRNA ya jeni X
Kuna nakala ngapi, hii ni quantification kabisa.Kawaida kile tunachotumia zaidi katika maabara ni njia ya kiasi cha jamaa.Kwa kawaida,njia ya 2-ΔΔctinatumika zaidi katika majaribio , kwa hivyo njia hii pekee ndiyo itatambulishwa kwa kina hapa.
2-ΔΔct mbinu: Matokeo yaliyopatikana ni tofauti katika usemi wa jeni lengwa katika kikundi cha majaribio kinachohusiana na jeni lengwa katika kikundi cha kudhibiti.Inahitajika kwamba utendakazi wa ukuzaji wa jeni lengwa na jeni la marejeleo la ndani uwe karibu na 100%, na mkengeuko wa jamaa usizidi 5%.
Mbinu ya kuhesabu ni kama ifuatavyo:
Δct kudhibiti kikundi = ct thamani ya jeni lengwa katika kikundi cha kudhibiti - ct thamani ya jeni ya kumbukumbu ya ndani katika kikundi cha kudhibiti
Δct kikundi cha majaribio = thamani ya ct ya jeni lengwa katika kikundi cha majaribio - ct thamani ya jeni ya marejeleo ya ndani katika kikundi cha majaribio
ΔΔct=Δct kikundi cha majaribio-Δct kudhibiti kikundi
Mwishowe, hesabu anuwai ya tofauti katika kiwango cha kujieleza:
Badilisha Fold=2-ΔΔct (inayolingana na utendaji bora wa Excel ni POWER)
Bidhaa zinazohusiana:
Seli ya moja kwa moja ya RT-qPCR
Muda wa kutuma: Mei-20-2023
