Ⅰ. Kuongeza unyeti wa mfumo wa mmenyuko:

1. Tenganisha RNA ya ubora wa juu:

Usanisi wa cDNA uliofaulu hutoka kwa RNA ya ubora wa juu.RNA ya ubora wa juu inapaswa kuhakikisha angalau muda mrefu zaidi na haina vizuizi ambavyo havina vimeng'enya vya kurekodi, kama vile EDTA au SDS.Ubora wa RNA huamua thamani ya juu zaidi ya maelezo ya mfuatano unayoweza kunakili kwa cDNA.Njia ya jumla ya utakaso wa RNA ni njia ya hatua ya kutumia isoocyanate/acidophenol.Ili kuzuia uchafuzi wa RNase, RNA iliyotenganishwa na sampuli iliyojaa RNase (kama vile kongosho) inahitaji uhifadhi wa formaldehyde ili kuokoa RNA ya hali ya juu, ambayo ni muhimu zaidi kwa uhifadhi wa muda mrefu.RNA iliyotolewa kutoka kwa ini ya panya iliharibiwa kimsingi baada ya wiki moja ya kuhifadhiwa kwenye maji, wakati RNA iliyotolewa kutoka kwa wengu wa panya ilibaki thabiti baada ya miaka mitatu ya kuhifadhi maji.Zaidi ya hayo, manukuu makubwa kuliko 4kb ni nyeti zaidi kufuatilia uharibifu wa RNase kuliko manukuu madogo.Ili kuongeza uthabiti wa sampuli ya hifadhi ya RNA, RNA inaweza kuyeyushwa katika methalmamine ya ioni, na kuhifadhiwa -70 °C.Thylide inayotumika kuhifadhi RNA lazima isiwe na vitu vingine vinavyoharibu RNA.RNA, ambayo inatokana na kongosho, inaweza kuhifadhiwa katika methalmamine kwa angalau mwaka mmoja.Ukiwa tayari kutumia RNA, unaweza kutumia mbinu zifuatazo ili kuongeza kasi ya RNA: ongeza NaCl hadi 0.2m na mara 4 ya ujazo wa ethanol, weka joto la chumba kwa dakika 3-5, na 10,000 × g centrifugal kwa dakika 5.

2. Tumia transcriptase reverse bila shughuli ya RNaseH (RNaseH-):

Vizuizi vya RNase mara nyingi huongezwa ili kubadilisha athari za unukuzi ili kuongeza urefu na mavuno ya usanisi wa cDNA.Kizuizi cha RNase huongezwa katika mmenyuko wa usanisi wa mnyororo wa kwanza kukiwa na vihifadhi na vinakisishaji kama vile DTT kwa sababu mchakato wa usanisi wa kabla ya cDNA hubadilisha kiviza, na hivyo kutoa RNazi zilizounganishwa ambazo huharibu RNA.Inhibitor ya protini ya RNase huzuia tu uharibifu wa RNA na RNase A, B, C, na usizuie RNases kwenye ngozi, hivyo uangalizi unapaswa kuchukuliwa ili usiingize RNases kutoka kwa vidole licha ya matumizi ya inhibitors hizi.

Reverse transcriptase huchochea ubadilishaji wa RNA kuwa cDNA.M-MLV na AMV zote zina shughuli asilia ya RNaseH pamoja na shughuli zao za polima.Shughuli ya RNaseH hushindana na shughuli ya polimerasi kwa nyuzi za heterozygous zinazoundwa kati ya violezo vya RNA na vianzio vya DNA au nyuzi za upanuzi za cDNA, na huharibu viwango vya RNA: nyuzi za RNA katika changamano za DNA.Violezo vya RNA vilivyoharibiwa na shughuli ya RNaseH haviwezi kutumika tena kama viunzi vyema vya usanisi wa cDNA, kupunguza mavuno na urefu wa usanisi wa cDNA.Hivyo basi kuondoa au kupunguza sana shughuli ya RNaseH ya reverse transcriptase itakuwa na manufaa makubwa.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase ya RNaseH- na thermoScript reverse transcriptase, AMV ya RNaseH- ilitoa cDNA ya urefu kamili zaidi ya MMLV na AMV.Unyeti wa RT-PCR huathiriwa na kiasi cha cDNA iliyosanisishwa.ThermoScript ni nyeti zaidi kuliko AMV.Ukubwa wa bidhaa za RT-PCR hupunguzwa na uwezo wa reverse transcriptase kusanisi cDNA, hasa wakati wa kuunda Cdna kubwa zaidi.Ikilinganishwa na MMLV, SuperScripⅡ iliongeza kwa kiasi kikubwa mavuno ya bidhaa ndefu za RT-PCR.RNaseH-'s reverse transcriptase pia huongeza uthabiti wa joto, kwa hivyo majibu yanaweza kufanywa kwa joto la juu kuliko kawaida la 37-42 ℃.Chini ya hali zilizopendekezwa za usanisi, vianzio vya oligo(dT) na 10μCi [alpha-p]dCTP vilitumika.Uzalishaji wa jumla wa msururu wa kwanza ulikokotolewa kwa kutumia mbinu ya TCA ya kunyesha.cDNA ya urefu kamili ilichanganuliwa kwa kutumia uondoaji wa mstari uliopangwa kwa ukubwa na kuhesabiwa katika jeli ya agarose ya alkali.

3. Ongeza halijoto ya kuhifadhi joto ya unukuzi wa kinyume:

Joto la juu la kushikilia husaidia kufungua muundo wa sekondari wa RNA na kuongeza mavuno ya mmenyuko.Kwa violezo vingi vya RNA, kushikilia RNA na primer kwa 65°C bila bafa au chumvi na kisha kuvipoza haraka kwenye barafu huondoa miundo ya pili na kuruhusu vianzio kushikana.Hata hivyo, baadhi ya templates bado zina muundo wa pili, hata baada ya denaturation ya joto.Ukuzaji wa violezo hivi vigumu unaweza kufanywa kwa kutumia ThermoScript reverse transcriptase na kwa kuweka athari ya reverse transcriptase kwenye viwango vya juu vya joto ili kuboresha ukuzaji.Viwango vya juu vya halijoto vinaweza pia kuongeza umaalum, hasa wakati usanisi wa cDNA unafanywa kwa kutumia vianzilishi maalum vya jeni (GSPS) (angalia Sura ya 3).Ikiwa unatumia GSP, hakikisha kuwa thamani ya Tm ya kitangulizi ni sawa na halijoto ya kushikilia inayotarajiwa.Usitumie oligo(dT) na vianzilishi nasibu zaidi ya 60℃.Vianzilishi bila mpangilio vinahitaji kushikiliwa kwa 25℃ kwa dakika 10 kabla ya kuongezeka hadi 60℃.Kando na kutumia halijoto ya juu zaidi ya unukuzi, umaalum unaweza kuboreshwa kwa kuhamisha moja kwa moja mchanganyiko wa RNA/ primer kutoka halijoto ya 65℃ ya kubadilisha hadi halijoto ya kushikilia unukuzi kinyume na kuongeza mchanganyiko wa majibu ya 2× uliotanguliwa (utangulizi wa uanzishaji wa mafuta ya cDNA).Njia hii husaidia kuzuia uunganishaji wa msingi wa intermolecular ambao hutokea kwa joto la chini.Kutumia kifaa cha PCR hurahisisha swichi nyingi za halijoto zinazohitajika kwa RT-PCR.

Polimasi iliyoimarishwa ya joto hutumika kama polimerasi ya DNA katika uwepo wa polimerasi ya Mg2+ na RNA mbele ya Mn2+.Inaweza kuhimili joto hadi 65 ℃.Hata hivyo, kuwepo kwa Mn2+ wakati wa PCR hupunguza uaminifu, ambayo hufanya Tth polymerase kutofaa kwa ukuzaji wa usahihi wa hali ya juu, kama vile cDNA cloning.Zaidi ya hayo, Tth haina ufanisi katika unukuzi wa kinyume, ambao hupunguza usikivu, na kwa kuwa kimeng'enya kimoja kinaweza kufanya unukuzi wa kinyume na PCR, miitikio ya udhibiti bila unukuzi wa kinyume haiwezi kutumika kutofautisha bidhaa zilizokuzwa za cDNA na zile za DNA iliyochafuliwa.

4. Nyongeza ambayo inakuza unukuzi wa kinyume:

Kuongezewa kwa viungio, ikiwa ni pamoja na glycerin na DMSO, kwa mmenyuko wa awali wa awali wa mnyororo kunaweza kupunguza uthabiti wa nyuzi mbili za nucleic asidi na kufuta muundo wa sekondari wa RNA.Hadi 20% ya glycerin au 10% DMSO inaweza kuongezwa bila kuathiri shughuli za SuperScriptⅡ au MMLV.AMV pia inaweza kuvumilia hadi 20% ya glycerol bila kupunguza shughuli.Ili kuongeza usikivu wa RT-PCR katika majibu ya unukuzi wa kinyume cha SuperScriptⅡ, 10% ya glycerol inaweza kuongezwa na kuwekwa maboksi kwa 45℃.Ikiwa 1/10 ya bidhaa ya retrotranscription-reaction imeongezwa kwa PCR, mkusanyiko wa glycerol katika mmenyuko wa amplification ni 0.4%, ambayo haitoshi kuzuia PCR.

5. Usindikaji wa RNaseH:

Unyeti unaweza kuboreshwa kwa kutibu miitikio ya usanisi ya cDNA na RNaseH kabla ya PCR.Kwa violezo vingine, inadhaniwa kuwa RNA katika mmenyuko wa usanisi wa cDNA huzuia kuunganishwa kwa bidhaa zilizoimarishwa, katika hali ambayo matibabu ya RNaseH yanaweza kuongeza usikivu.Kwa ujumla, matibabu ya RNaseH yanahitajika kwa ajili ya ukuzaji wa kiolezo kinacholengwa cha cDNA cha urefu kamili, kama vile tuberous scheresiⅡ chenye nakala ndogo.Kwa kiolezo hiki kigumu, RNaseH iliboresha mawimbi yanayotolewa na cDNA iliyosanisishwa na SuperScriptⅡ au AMV.Kwa miitikio mingi ya RT-PCR, matibabu ya RNaseH ni ya hiari kwa sababu hatua ya urekebishaji wa 95℃ iliyowekewa maboksi ya PCR kwa kawaida husafisha RNA kutoka kwa RNA: DNA changamano.

6. Mbinu zilizoboreshwa za kugundua kiasi kidogo cha RNA:

RT-PCR ni changamoto hasa wakati kiasi kidogo tu cha RNA kinapatikana.Kuongezewa kwa glycogen kama carrier wakati wa kutenganisha RNA husaidia kuongeza mavuno ya sampuli ndogo.Glycogen isiyo na RNase inaweza kuongezwa kwa wakati mmoja na Trizol.Glycojeni huyeyuka katika maji na inaweza kubaki katika awamu ya maji na RNA ili kusaidia katika kunyesha baadae.Mkusanyiko unaopendekezwa wa glycogen isiyo na RNase ni 250μg/ml kwa sampuli chini ya 50mg za tishu au seli 106 zilizokuzwa.

Kuongezwa kwa BSA ya acetylated ili kubadilisha athari za unukuzi kwa kutumia SuperScriptⅡ kunaweza kuongeza usikivu, na kwa kiasi kidogo cha RNA, kupunguza kiwango cha SuperScriptⅡ na kuongeza vitengo 40 vya RnaseOut nuclease inhibitor kunaweza kuboresha kiwango cha utambuzi.Ikiwa glycojeni itatumika katika utenganishaji wa RNA, kuongezwa kwa vizuizi vya BSA au RNase ili kubadilisha miitikio ya unukuzi kwa kutumia SuperScriptⅡ bado inapendekezwa.

Ⅱ. Ongeza maalum ya RT-PCR

1. Mchanganyiko wa cNDA:

Mbinu tatu tofauti zinaweza kutumika kuanzisha usanisi wa safu ya kwanza ya cDNA, na umahususi wa jamaa wa kila mbinu huathiri kiasi na aina ya cDNA iliyosanisishwa.

Njia ya utangulizi isiyo ya kawaida ni njia maalum zaidi ya njia tatu.Vitambulisho vinanaswa kwenye tovuti nyingi katika nakala ili kutoa cDNA fupi na ya urefu usio kamili.Njia hii mara nyingi hutumiwa kupata 5′ mfuatano wa mwisho na cDNA kutoka violezo vya RNA vilivyo na maeneo ya miundo ya pili au na tovuti za kukatisha ambazo transcriptase ya kinyume haiwezi kunakiliwa.Ili kupata cDNA ndefu zaidi, uwiano wa vianzio kwa RNA katika kila sampuli ya RNA unahitaji kubainishwa kwa nguvu.Mkusanyiko wa awali wa vianzio nasibu huanzia 50 hadi 250ng kwa kila mfumo wa majibu 20μl.Kwa sababu cDNA iliyounganishwa kutoka jumla ya RNA kwa kutumia viasili nasibu ni RNA ya ribosomal, aina nyingi(A)+RNA kwa ujumla huchaguliwa kama kiolezo.

Uanzishaji wa Oligo(dT) ni mahususi zaidi kuliko vianzilishi nasibu.Inachanganywa na mkia wa poli(A) unaopatikana kwenye mwisho wa 3′ wa mRNA katika seli nyingi za yukariyoti.Kwa sababu poly(A)+RNA ni takriban 1% hadi 2% ya jumla ya RNA, kiasi na utata wa cDNA ni mdogo sana kuliko kama vianzio nasibu vilitumiwa.Kwa sababu ya umaalum wake wa hali ya juu, oligo(dT) kwa ujumla haihitaji uboreshaji wa uwiano wa RNA hadi primer na uteuzi wa aina nyingi(A)+.Inapendekezwa kutumia 0.5μg oligo(dT) kwa kila mfumo wa mmenyuko wa 20μl.oligo(dT)12-18 inafaa kwa RT-PCR nyingi.Mfumo wa ThermoScript RT-PCR hutoa oligo(dT)20 kwa sababu ya uthabiti wake mzuri wa joto na unafaa kwa halijoto ya juu zaidi.

Vitambulisho vya jeni mahususi (GSP) ni vianzilishi bora zaidi mahususi kwa hatua ya unukuzi wa kinyume.GSP ni oligonucleoside isiyo na hisia ambayo inaweza kuchanganywa haswa na mifuatano lengwa ya RNA, badala ya kuchuja Rna zote kama vile vianzio nasibu au oligo(dT).Sheria zinazotumika kuunda vianzio vya PCR pia hutumika kwa muundo wa majibu ya unukuzi ya kinyume cha GSP.GSP inaweza kuwa mfuatano sawa na kiambishi awali cha ukuzaji kilichofungwa mwishoni mwa mRNA3′, au GSP inaweza kuundwa ili kuingizwa chini ya mkondo kwa kianzilishi cha nyuma cha ukuzaji.Kwa baadhi ya vitu vilivyoimarishwa, ni muhimu kuunda zaidi ya kitangulizi kimoja cha antisense kwa ajili ya RT-PCR iliyofaulu kwa sababu muundo wa pili wa RNA lengwa unaweza kuzuia kitangulizi kutoka kwa kufunga.Inapendekezwa kutumia 1pmol antisense GSP katika mfumo wa mmenyuko wa awali wa mnyororo wa 20μl.

2. Ongeza halijoto ya kuhifadhi joto ya unukuzi wa kinyume:

Ili kunufaika kikamilifu na umaalumu wa GSP, nakala ya reverse iliyo na uthabiti wa hali ya juu ya joto inapaswa kutumika.Reverse transcriptase ya uthabiti wa joto inaweza kuwekwa kwenye viwango vya juu vya joto ili kuongeza ukali wa athari.Kwa mfano, ikiwa GSP imezuiliwa kwa 55°C, basi umaalumu wa GSP hautatumika kikamilifu ikiwa unukuzi wa kinyume unafanywa kwa 37°C kwa ukali wa chini kwa kutumia AMV au M-MLV.Hata hivyo, SuperScripⅡ na ThermoScript zinaweza kuitikia kwa 50℃ au zaidi, ambayo huondoa bidhaa zisizo mahususi zinazozalishwa kwa viwango vya chini vya joto.Kwa umaalum wa juu zaidi, mchanganyiko wa RNA/ primer unaweza kuhamishwa moja kwa moja kutoka kwa halijoto ya 65℃ hadi kwenye halijoto ya kushikilia unukuzi kinyume na kuongezwa kwa mchanganyiko wa mmenyuko wa 2 x uliotanguliwa (uanzishaji wa joto wa usanisi wa cDNA).Hii husaidia kuzuia kuoanisha msingi kati ya molekuli kwenye joto la chini.Kutumia kifaa cha PCR hurahisisha mabadiliko mengi ya halijoto yanayohitajika kwa RT-PCR.

3. Punguza uchafuzi wa DNA ya jeni:

Shida moja inayoweza kutokea na RT-PCR ni kwamba RNA inachafua DNA ya jeni.Matumizi ya mbinu bora za kutenganisha RNA, kama vile Trizol Reagent, hupunguza uchafuzi wa DNA ya jeni katika maandalizi ya RNA.Ili kuzuia bidhaa zinazozalishwa kutoka kwa DNA ya jeni, RNA inaweza kutibiwa kwa daraja la DnasⅠ ili kuondoa DNA iliyoambukizwa kabla ya kutengua unukuzi.Sampuli ziliwekwa kwa 65℃ katika 2.0mM EDTA kwa dakika 10 ili kukomesha usagaji chakula wa DNaseⅠ.EDTA huchezea ioni za magnesiamu ili kuzuia hidrolisisi ya RNA tegemezi ya ioni ya magnesiamu ambayo hutokea kwenye joto la juu.

Ili kutenganisha cDNA iliyoimarishwa kutoka kwa bidhaa ya ukuzaji wa DNA ya jenomu, vianzio ambavyo huchujwa kando na exoni iliyotenganishwa vinaweza kutengenezwa.Bidhaa za PCR zinazotokana na cDNA zitakuwa fupi kuliko zile zinazotokana na DNA ya jeni iliyoambukizwa.Jaribio linalodhibitiwa bila unukuzi wa kinyume pia hufanywa kwenye kila kiolezo cha RNA ili kubaini ikiwa kipande fulani kimetoka kwa DNA ya jeni au cDNA.Bidhaa za PCR zilizopatikana kwa kukosekana kwa maandishi ya nyuma zinatokana na jenomu.

Bidhaa inayohusiana

RT-PCR Rahisi^ᵀᴹMimi (Hatua Moja)

-Seti ya hatua moja huwezesha unukuzi wa kinyume na PCR kutekelezwa katika bomba sawa.Inahitaji tu kuongeza kiolezo cha RNA, vianzio maalum vya PCR na ddH ya RNase-Free₂O.

-Uchambuzi wa muda halisi wa RNA unaweza kufanywa haraka na kwa usahihi.

-Kifaa hiki kinatumia kitendanishi cha kipekee cha unukuzi cha Foregene reverse na Foregene HotStar Taq DNA Polymerase pamoja na mfumo wa kipekee wa maitikio ili kuboresha ufanisi wa ukuzaji na umahususi wa athari.

-Mfumo wa majibu ulioboreshwa hufanya majibu kuwa na unyeti wa juu wa utambuzi, uthabiti mkubwa wa joto, na uvumilivu bora.

RT Easy II(Pamoja na GDNase) Master Premix Kwa Ajili ya Mchanganyiko wa CDNA wa Awamu ya Kwanza Kwa PCR ya Wakati Halisi Na GDNase

-Uwezo mzuri wa kuondoa gDNA, ambayo inaweza kuondoa gDNA kwenye kiolezo ndani ya dakika 2.

-Mfumo mzuri wa unukuzi wa nyuma, inachukua dakika 15 tu kukamilisha usanisi wa safu ya kwanza ya cDNA.

-Violezo tata: violezo vilivyo na maudhui ya juu ya GC na muundo changamano wa pili pia vinaweza kubadilishwa kwa ufanisi wa juu.

-Mfumo wa unukuzi wa reverse wenye usikivu wa hali ya juu, violezo vya kiwango cha pg pia vinaweza kupata cDNA ya ubora wa juu.

-Mfumo wa unukuu wa kinyume una uthabiti wa hali ya juu wa joto, halijoto ya kufaa zaidi ya maitikio ni 42℃, na bado una utendaji mzuri wa unukuzi wa kinyume katika 50℃.