一、Kuongeza unyeti wa mfumo wa mmenyuko:

1. Tenga RNA ya hali ya juu:

Usanisi wa cDNA uliofaulu hutoka kwa RNA ya ubora wa juu.RNA ya ubora wa juu inapaswa angalau kuwa na urefu kamili na isiyo na vizuizi vya reverse transcriptase kama vile EDTA au SDS.Ubora wa RNA huamua kiwango cha juu zaidi cha maelezo ya mfuatano unayoweza kunakili katika cDNA.Njia ya kawaida ya utakaso wa RNA ni njia ya hatua moja kwa kutumia guanidine isothiocyanate/fenoli ya asidi.Ili kuzuia uchafuzi wa idadi ya RNase, RNA iliyotengwa na sampuli zenye utajiri wa RNase (kama vile kongosho) inahitaji kuhifadhiwa katika formaldehyde ili kuhifadhi RNA ya ubora wa juu, hasa kwa uhifadhi wa muda mrefu.RNA iliyotolewa kwenye ini ya panya iliharibiwa kimsingi baada ya kuhifadhiwa kwenye maji kwa wiki moja, huku RNA iliyotolewa kutoka kwa wengu wa panya ilibaki thabiti baada ya kuhifadhiwa kwenye maji kwa miaka 3.Kwa kuongeza, manukuu yenye urefu wa zaidi ya kb 4 ni nyeti zaidi kwa uharibifu kwa kufuatilia RNase kuliko nakala ndogo.Ili kuongeza uthabiti wa sampuli za RNA zilizohifadhiwa, RNA inaweza kuyeyushwa katika deionized formamide na kuhifadhiwa katika -70°C.Formamide inayotumiwa kuhifadhi RNA lazima isiwe na uchafu unaoharibu RNA.RNA kutoka kwa kongosho inaweza kuhifadhiwa katika formamide kwa angalau mwaka mmoja.Wakati wa kuandaa kutumia RNA, unaweza kutumia njia ifuatayo ili kuharakisha RNA: ongeza NaCl hadi 0.2M na mara 4 ya kiasi cha ethanol, weka kwenye joto la kawaida kwa dakika 3-5, na centrifuge kwa 10,000 × g kwa dakika 5.

2. Tumia RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase:

Vizuizi vya RNase mara nyingi huongezwa ili kubadilisha athari za unukuzi ili kuongeza urefu na mavuno ya usanisi wa cDNA.Vizuizi vya RNase vinapaswa kuongezwa wakati wa mmenyuko wa usanisi wa safu ya kwanza mbele ya bafa na wakala wa kupunguza (kama vile DTT), kwa sababu mchakato wa kabla ya usanisi wa cDNA hubadilisha kiviza, na hivyo kutoa RNase iliyofungwa ambayo inaweza kuharibu RNA.Vizuizi vya protini vya RNase huzuia tu uharibifu wa RNA na RNase A, B, C, na usizuie RNase kwenye ngozi, hivyo kuwa mwangalifu usianzisha RNase kutoka kwa vidole vyako licha ya matumizi ya inhibitors hizi.

Reverse transcriptase huchochea ubadilishaji wa RNA hadi cDNA.M-MLV na AMV zote zina shughuli asilia ya RNaseH pamoja na shughuli zao za polima.Shughuli ya RNaseH na shughuli ya polimerasi hushindana zenyewe kwa uzi mseto unaoundwa kati ya kiolezo cha RNA na kiambishi awali cha DNA au uzi wa upanuzi wa cDNA, na kuharibu uzi wa RNA katika RNA:DNA changamano.Kiolezo cha RNA kilichoharibiwa na shughuli ya RNaseH hakiwezi tena kutumika kama sehemu ndogo ya usanisi ya cDNA, ambayo inapunguza mavuno na urefu wa usanisi wa cDNA.Kwa hivyo, itakuwa ya manufaa kuondoa au kupunguza sana shughuli ya RNaseH ya reverse transcriptase..

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase na thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, inaweza kupata kiasi zaidi na cha urefu kamili zaidi wa cDNA kuliko MMLV na AMV.Unyeti wa RT-PCR utaathiriwa na kiasi cha usanisi wa cDNA.ThermoScript ni nyeti zaidi kuliko AMV.Ukubwa wa bidhaa za RT-PCR hupunguzwa na uwezo wa reverse transcriptase kusanisi cDNA, hasa wakati wa kuunda cDNA kubwa zaidi.Ikilinganishwa na MMLV, SuperScripⅡ iliongeza kwa kiasi kikubwa mavuno ya bidhaa ndefu za RT-PCR.RNaseH-reverse transcriptase pia imeongeza uthabiti wa joto, kwa hivyo majibu yanaweza kufanywa kwa joto la juu kuliko kawaida 37-42°C.Chini ya hali zilizopendekezwa za usanisi, tumia primer ya oligo(dT) na 10 μCi ya [α-P]dCTP.Mavuno ya jumla ya uzi wa kwanza yalikokotolewa kwa kutumia mbinu ya TCA ya kunyesha.cDNA ya urefu kamili ilichanganuliwa kwa kutumia bendi zilizopangwa kwa ukubwa zilizokatwa na kuhesabiwa kwenye jeli ya agarose ya alkali.

3. Ongeza halijoto ya incubation kwa unukuzi wa kinyume:

Joto la juu la incubation husaidia kufungua muundo wa sekondari wa RNA, na kuongeza mavuno ya mmenyuko.Kwa templates nyingi za RNA, incubating RNA na primers saa 65 ° C bila buffer au chumvi, ikifuatiwa na baridi ya haraka kwenye barafu itaondoa miundo ya pili na kuruhusu primers kufunga.Hata hivyo, baadhi ya templates bado zina miundo ya sekondari, hata baada ya denaturation ya joto.Ukuzaji wa violezo hivi vigumu unaweza kufanywa kwa kutumia ThermoScript Reverse Transcriptase na kuweka maitikio ya unukuzi wa kinyume kwenye halijoto ya juu ili kuboresha ukuzaji.Viwango vya juu vya halijoto pia vinaweza kuongeza umaalum, hasa wakati vianzilishi maalum vya jeni (GSP) vinapotumika kwa usanisi wa cDNA (angalia Sura ya 3).Iwapo unatumia GSP, hakikisha kuwa Tm ya vianzio ni sawa na halijoto inayotarajiwa ya incubation.Usitumie oligo(dT) na viasili nasibu vilivyozidi 60°C.Vianzio vya nasibu vinahitaji kuangukiwa kwenye 25°C kwa dakika 10 kabla ya kuongezeka hadi 60°C.Kando na kutumia halijoto ya juu zaidi ya unukuzi, umaalum pia unaweza kuboreshwa kwa kuhamisha mchanganyiko wa RNA/primer moja kwa moja kutoka halijoto ya 65°C hadi halijoto ya uandishi wa unukuzi kinyume na kuongeza mchanganyiko wa majibu ya 2× uliopashwa kabla (utangulizi wa kuanza kwa cDNA) .Njia hii husaidia kuzuia uunganishaji wa msingi wa intermolecular ambao hutokea kwa joto la chini.Ubadilishaji wa halijoto nyingi unaohitajika kwa RT-PCR unaweza kurahisishwa kwa kutumia kiendesha mzunguko wa joto.

Polimasi inayoweza kudhibiti joto hufanya kama polimerasi ya DNA mbele ya Mg2+ na kama polimerasi ya RNA mbele ya Mn2+.Inaweza kuwekwa kwenye joto kwa kiwango cha juu cha 65 ° C.Hata hivyo, kuwepo kwa Mn2+ wakati wa PCR hupunguza uaminifu, ambayo hufanya Tth polymerase kutofaa kwa ukuzaji wa usahihi wa juu, kama vile uundaji wa cDNA.Kwa kuongeza, Tth ina ufanisi wa chini wa unukuzi wa kinyume, ambao hupunguza usikivu, na, kwa kuwa unukuzi wa kinyume na PCR unaweza kufanywa kwa kimeng'enya kimoja, miitikio ya udhibiti bila unukuzi wa kinyume haiwezi kutumika kulinganisha bidhaa za ukuzaji wa cDNA na DNA inayochafua jeni.Bidhaa za ukuzaji zilitenganishwa.

4. Viongezeo vinavyokuza unukuzi wa kinyume:

Viungio ikiwa ni pamoja na glycerol na DMSO huongezwa kwa mmenyuko wa awali wa strand ya kwanza, ambayo inaweza kupunguza utulivu wa nucleic asidi ya nyuzi mbili na kufungua muundo wa pili wa RNA.Hadi 20% ya glycerol au 10% DMSO inaweza kuongezwa bila kuathiri SuperScript II au shughuli ya MMLV.AMV inaweza pia kuvumilia hadi 20% ya glycerol bila kupoteza shughuli.Ili kuongeza usikivu wa RT-PCR katika unukuzi wa kinyume cha SuperScriptⅡ, 10% ya glycerol inaweza kuongezwa na kuamilishwa ifikapo 45°C.Ikiwa 1/10 ya bidhaa ya majibu ya transcription ya reverse imeongezwa kwa PCR, basi mkusanyiko wa glycerol katika mmenyuko wa amplification ni 0.4%, ambayo haitoshi kuzuia PCR.

5. Matibabu ya RNaseH:

Matibabu ya athari za usanisi wa cDNA na RNaseH kabla ya PCR inaweza kuongeza usikivu.Kwa violezo vingine, inadhaniwa kuwa RNA katika mmenyuko wa usanisi wa cDNA huzuia kuunganishwa kwa bidhaa za ukuzaji, katika hali ambayo matibabu ya RNaseH yanaweza kuongeza usikivu.Kwa ujumla, matibabu ya RNaseH ni muhimu wakati wa kukuza violezo vya urefu kamili vya cDNA vinavyolengwa, kama vile tuberous scherosis II ya nakala ya chini.Kwa kiolezo hiki kigumu, matibabu ya RNaseH yaliboresha mawimbi yanayotolewa na SuperScript II au cDNA iliyosanifiwa na AMV.Kwa miitikio mingi ya RT-PCR, matibabu ya RNaseH ni ya hiari, kwa sababu hatua ya uchanganuzi wa PCR ifikapo 95°C kwa ujumla husafisha RNA katika RNA:DNA changamani.

6. Uboreshaji wa Njia Ndogo ya Kugundua RNA:

RT-PCR ni changamoto hasa wakati kiasi kidogo tu cha RNA kinapatikana.Glycogen iliyoongezwa kama carrier wakati wa kutengwa kwa RNA husaidia kuongeza mavuno ya sampuli ndogo.Glycogen isiyo na RNase inaweza kuongezwa kwa wakati mmoja na kuongeza Trizol.Glycojeni huyeyushwa na maji na inaweza kuhifadhiwa katika awamu ya maji yenye RNA ili kusaidia kunyesha baadae.Kwa sampuli chini ya 50 mg ya tishu au seli 106 zilizokuzwa, ukolezi uliopendekezwa wa glycogen isiyo na RNase ni 250 μg/ml.

Kuongeza acetylated BSA kwenye maitikio ya unukuzi wa kinyume kwa kutumia SuperScript II kunaweza kuongeza usikivu, na kwa kiasi kidogo cha RNA, kupunguza kiwango cha SuperScript II na kuongeza vitengo 40 vya RNaseOut nuclease inhibitor kunaweza kuongeza kiwango cha utambuzi.Iwapo glycojeni itatumika katika mchakato wa kutengwa kwa RNA, bado inashauriwa kuongeza kizuizi cha BSA au RNase unapotumia SuperScript II kwa athari ya unukuzi kinyume.

二、 Ongeza umaalum wa RT-PCR

1. Usanisi wa CND:

Usanisi wa cDNA wa mstari wa kwanza unaweza kuanzishwa kwa kutumia mbinu tatu tofauti, umaalum wa jamaa ambao huathiri kiasi na aina ya cDNA iliyosanisishwa.

Njia ya utangulizi nasibu ilikuwa njia mahususi kabisa kati ya hizo tatu.Vitambulisho vya kwanza vinasambazwa katika tovuti nyingi katika manukuu, na kuzalisha cDNA fupi, za urefu usio kamili.Njia hii hutumiwa mara kwa mara kupata mfuatano wa mwisho wa 5′ na kupata cDNA kutoka violezo vya RNA na maeneo ya muundo wa pili au na tovuti za kukomesha ambazo haziwezi kuigwa na reverse transcriptase.Ili kupata cDNA ndefu zaidi, uwiano wa vianzio kwa RNA katika kila sampuli ya RNA unahitaji kubainishwa kwa nguvu.Mkusanyiko wa kuanzia wa primers random ulianzia 50 hadi 250 ng kwa majibu ya 20 μl.Kwa kuwa cDNA iliyounganishwa kutoka jumla ya RNA kwa kutumia viasili nasibu kimsingi ni RNA ya ribosomal, aina nyingi(A)+RNA kwa ujumla huchaguliwa kama kiolezo.

Vitangulizi vya Oligo(dT) ni mahususi zaidi kuliko vianzilishi nasibu.Inachanganya hadi mkia wa aina nyingi(A) unaopatikana kwenye mwisho wa 3′ wa mRNA nyingi za yukariyoti.Kwa sababu poly(A)+ RNA ni takriban 1% hadi 2% ya jumla ya RNA, kiasi na utata wa cDNA ni mdogo sana kuliko na vianzio nasibu.Kwa sababu ya umaalum wake wa hali ya juu, oligo(dT) kwa ujumla haihitaji uboreshaji wa uwiano wa RNA na vianzio na uteuzi wa aina nyingi(A)+.Inapendekezwa kutumia 0.5μg oligo(dT) kwa kila mfumo wa mmenyuko wa 20μl.oligo(dT)12-18 inafaa kwa RT-PCR nyingi.Mfumo wa ThermoScript RT-PCR hutoa oligo(dT)20 kwa sababu ya uthabiti wake bora wa joto kwa halijoto ya juu ya incubation.

Viunzilishi maalum vya jeni (GSP) ndivyo vianzilishi mahususi zaidi kwa hatua ya unukuzi wa kinyume.GSP ni oligonucleotidi isiyo na hisia ambayo inaweza kuchanganywa haswa hadi mfuatano lengwa wa RNA, tofauti na vianzio nasibu au oligo(dT), ambayo huhusisha RNA zote.Sheria zile zile zinazotumiwa kuunda vianzio vya PCR hutumika kwa muundo wa GSP katika miitikio ya unukuzi wa kinyume.GSP inaweza kuwa mfuatano sawa na kiambishi awali cha ukuzaji ambacho huingia hadi mwisho wa 3′-wengi wa mRNA, au GSP inaweza kuundwa ili kupunguza mkondo wa kianzilishi cha nyuma cha ukuzaji.Kwa baadhi ya masomo yaliyoimarishwa, zaidi ya kitangulizi kimoja cha antisense kinahitaji kuundwa kwa ajili ya RT-PCR iliyofaulu kwa sababu muundo wa pili wa RNA lengwa unaweza kuzuia ufungaji wa vianzio.Inapendekezwa kutumia 1 pmol antisense GSP katika mmenyuko wa awali wa 20 μl wa kwanza.

2. Ongeza halijoto ya incubation kwa unukuzi wa kinyume:

Ili kutumia kikamilifu manufaa kamili ya umaalum wa GSP, nakala ya kinyume iliyo na uwezo wa hali ya juu wa joto inapaswa kutumika.Nakala za reverse zinazoweza kudhibiti joto zinaweza kuamilishwa kwa viwango vya juu vya joto ili kuongeza ukali wa athari.Kwa mfano, ikiwa GSP itapungua kwa 55°C, umaalum wa GSP hautatumika kikamilifu ikiwa AMV au M-MLV itatumika kwa unukuzi wa kinyume kwa ukali wa chini wa 37°C.Hata hivyo, SuperScript II na ThermoScript zinaweza kuitikiwa kwa 50°C au zaidi, ambayo itaondoa bidhaa zisizo mahususi zinazozalishwa kwa halijoto ya chini.Kwa umaalum wa hali ya juu zaidi, mchanganyiko wa RNA/primer unaweza kuhamishwa moja kwa moja kutoka kwa halijoto ya 65°C hadi halijoto ya uandishi ya unukuzi kinyume na kuongezwa kwenye mchanganyiko wa mmenyuko wa 2× uliopashwa kabla (mwanzo moto wa awali wa cDNA).Hii husaidia kuzuia kuoanisha kwa msingi kati ya molekuli kwa joto la chini.Mabadiliko mengi ya halijoto yanayohitajika kwa RT-PCR yanaweza kurahisishwa kwa kutumia kiendesha mzunguko wa joto.

3. Hupunguza uchafuzi wa DNA ya jeni:

Shida inayoweza kukumba RT-PCR ni uchafuzi wa DNA ya jeni katika RNA.Kutumia mbinu nzuri ya kutenganisha RNA, kama vile Trizol Reagent, kutapunguza kiwango cha DNA ya jeni inayochafua utayarishaji wa RNA.Ili kuepuka bidhaa zinazotokana na DNA ya jeni, RNA inaweza kutibiwa kwa kiwango cha ukuzaji cha DNase I ili kuondoa DNA inayochafua kabla ya kubadilisha unukuzi.Usagaji chakula wa DNase I ulikomeshwa kwa kuangulia sampuli katika 2.0 mM EDTA kwa dakika 10 kwa 65°C.EDTA inaweza chelate ioni za magnesiamu, kuzuia hidrolisisi ya RNA inayotegemea ioni ya magnesiamu kwenye joto la juu.

Ili kutenganisha cDNA iliyoimarishwa na kuchafua bidhaa za ukuzaji wa DNA za jeni, vianzio vinaweza kuundwa ili kila mchujo kutenganisha exons.Bidhaa za PCR zinazotokana na cDNA zitakuwa fupi kuliko zile zinazotokana na DNA ya jeni iliyoambukizwa.Zaidi ya hayo, jaribio la kudhibiti bila unukuzi wa kinyume lilifanyika kwenye kila kiolezo cha RNA ili kubaini ikiwa kipande fulani kilitolewa kutoka kwa DNA ya jeni au cDNA.Bidhaa ya PCR iliyopatikana bila unukuzi wa kinyume inatokana na jenomu.