Muhtasari
Utambulisho wa haraka wa mimea ya transgenic
Maandishi/Tong Yucheng
Operesheni ya majaribio/Han Ying
Mhariri/Wen Youjun
Maneno/1600+
Muda unaopendekezwa wa kusoma/dakika 8-10
Utambulisho wa haraka wa mimea ya transgenic
Kama mgeni katika maabara, si kazi nzuri kuchunguza mimea chanya kutoka kwa kundi la mimea yenye kiwango cha chini cha ubadilishaji.Kwanza, DNA lazima itolewe kutoka kwa idadi kubwa ya sampuli moja baada ya nyingine, na kisha jeni za kigeni zitagunduliwa na PCR.Hata hivyo, matokeo mara nyingi huwa tupu na mikanda yenye vipengee vichache mara kwa mara, lakini haiwezekani kubainisha ikiwa kuna ugunduzi ambao haujakamilika au ugunduzi wa uwongo..Je, ni hoi sana kukabiliana na mchakato kama huu wa majaribio na matokeo?Usijali, ndugu anakufundisha jinsi ya kuchunguza mimea chanya isiyobadilika kwa urahisi na kwa usahihi.
Hatua ya 1: Vitangulizi vya utambuzi wa muundo
Amua jeni asilia na jeni ya nje ya kutambuliwa kulingana na sampuli ya kujaribiwa, na uchague kiwakilishi cha mfululizo wa 100-500bp katika jeni kwa muundo wa kitangulizi.Vitangulizi vyema vinaweza kuhakikisha usahihi wa matokeo ya ugunduzi na kufupisha muda wa ugunduzi (angalia kiambatisho cha vianzilishi vya utambuzi vinavyotumika kawaida).
Kumbuka:
Vitambulisho vipya vilivyoundwa vinahitaji kuboresha hali ya majibu na kuthibitisha usahihi, usahihi na kikomo cha ugunduzi kabla ya kufanya ugunduzi wa kiwango kikubwa.
Hatua ya 2:Tengeneza itifaki ya majaribio
Udhibiti chanya: Tumia DNA iliyosafishwa iliyo na kipande kinacholengwa kama kiolezo ili kubainisha kama mfumo na masharti ya PCR ni ya kawaida.
Udhibiti hasi/tupu: Tumia kiolezo cha DNA au ddH2O ambayo haina kipande kinacholengwa kama kiolezo cha kugundua kama kuna chanzo cha uchafuzi katika mfumo wa PCR.
Udhibiti wa ndani wa marejeleo: tumia kitangulizi/kichunguzi cha mchanganyiko wa jeni asilia ya sampuli ili kujaribiwa ili kutathmini ikiwa kiolezo kinaweza kutambuliwa na PCR.
Kumbuka:
Vidhibiti chanya, hasi/tupu na vidhibiti vya udhibiti wa ndani vinapaswa kuwekwa kwa kila jaribio ili kutathmini uhalali wa matokeo ya majaribio.
Hatua ya 3: Maandalizi ya majaribio
Kabla ya matumizi, angalia ikiwa suluhisho limechanganywa sawasawa.Ikiwa mvua imepatikana, inahitaji kufutwa na kuchanganywa kulingana na maagizo kabla ya matumizi.Mchanganyiko wa 2×PCR unahitaji kupigwa bomba na kuchanganywa mara kwa mara na micropipette kabla ya matumizi ili kuzuia usambazaji usio sawa wa ioni.
Kumbuka:
Toa maagizo na uisome kwa uangalifu, na ufanye maandalizi kabla ya jaribio kwa kufuata madhubuti na maagizo.
Hatua ya 4: Andaa mfumo wa majibu wa PCR
Kulingana na itifaki ya majaribio, changanya vitangulizi, H2O, 2×PCR mchanganyiko, centrifuge na uwasambaze kwa kila bomba la majibu.
Kumbuka:
Kwa upimaji wa kiwango kikubwa au cha muda mrefu, inashauriwa kutumia mfumo wa mmenyuko wa PCR ulio na enzyme ya UNG, ambayo inaweza kuzuia kwa ufanisi uchafuzi wa erosoli unaosababishwa na bidhaa za PCR.
Hatua ya 5: Ongeza kiolezo cha majibu
Kwa kutumia teknolojia ya Direct PCR, hakuna haja ya mchakato mchovu wa utakaso wa asidi ya nukleiki.Kiolezo cha sampuli kinaweza kutayarishwa ndani ya dakika 10 na kuongezwa kwa mfumo unaolingana wa majibu ya PCR.
Kumbuka:
Mbinu ya Lysis ina athari bora ya kugundua, na bidhaa iliyopatikana inaweza kutumika kwa athari nyingi za utambuzi.
5.1: PCR ya moja kwa moja ya majani
Kwa mujibu wa ukubwa wa picha katika mwongozo, kata kitambaa cha jani na kipenyo cha 2-3mm na kuiweka kwenye mfumo wa majibu ya PCR.
Kumbuka: Hakikisha kwamba vipande vya majani vimetumbukizwa kabisa kwenye suluhisho la mmenyuko wa PCR, na usiongeze tishu nyingi za majani.
5.2: Mbinu ya kuchambua majani
Kata kitambaa cha jani na kipenyo cha 5-7mm na kuiweka kwenye tube ya centrifuge.Ikiwa unachagua majani yaliyoiva, tafadhali epuka kutumia tishu za mshipa mkuu wa jani.Pipette 50ul Buffer P1 lysate kwenye bomba la centrifuge ili kuhakikisha kwamba lysate inaweza kuzama kabisa tishu za jani, kuiweka kwenye mzunguko wa joto au umwagaji wa chuma, na lyse kwa 95 ° C kwa dakika 5-10.
Ongeza 50ul Buffer P2 ufumbuzi wa neutralization na kuchanganya vizuri.Lisate inayotokana inaweza kutumika kama kiolezo na kuongezwa kwa mfumo wa majibu ya PCR.
Kumbuka: Kiasi cha kiolezo kinapaswa kuwa kati ya 5-10% ya mfumo wa PCR, na haipaswi kuzidi 20% (kwa mfano, katika mfumo wa 20μl PCR, ongeza 1-2μl ya bafa ya lysis, si zaidi ya 4μl).
Hatua ya 6: Mwitikio wa PCR
Baada ya kuingiza bomba la majibu la PCR, ziweke kwenye kifaa cha PCR kwa ukuzaji.
Kumbuka:
Mwitikio hutumia kiolezo kisichotakaswa kwa ukuzaji, kwa hivyo idadi ya mizunguko ya ukuzaji ni mizunguko 5-10 zaidi kuliko wakati wa kutumia kiolezo cha DNA iliyosafishwa.
Hatua ya 7: Utambuzi wa Electrophoresis na uchanganuzi wa matokeo
M:100bp Ngazi ya DNA
1\4: Mbinu ya DNA iliyosafishwa
2\5: Mbinu ya PCR ya moja kwa moja
3\6: Udhibiti tupu
Udhibiti wa Ubora:
Matokeo ya majaribio ya vidhibiti mbalimbali vilivyowekwa kwenye jaribio yanafaa kutimiza masharti yafuatayo.Vinginevyo, sababu ya tatizo inapaswa kuchambuliwa, na mtihani unapaswa kufanywa tena baada ya tatizo kuondolewa.
Jedwali 1. Matokeo ya mtihani wa kawaida wa vikundi mbalimbali vya udhibiti
*Plamidi inapotumika kama kidhibiti chanya, matokeo ya mtihani wa jeni asilia yanaweza kuwa hasi
Hukumu ya matokeo:
A. Matokeo ya jaribio la jeni asilia ya sampuli ni hasi, ikionyesha kuwa DNA inayofaa kwa utambuzi wa kawaida wa PCR haiwezi kutolewa kutoka kwa sampuli au DNA iliyotolewa ina vizuizi vya athari ya PCR, na DNA inapaswa kutolewa tena.
B. Matokeo ya jaribio la jeni asilia ya sampuli ni chanya, na matokeo ya jaribio la jeni la nje ni hasi, ikionyesha kuwa DNA inayofaa kwa utambuzi wa kawaida wa PCR imetolewa kutoka kwa sampuli, na inaweza kutathminiwa kuwa jeni la XXX halijatambuliwa kwenye sampuli.
C. Matokeo ya jaribio la jeni asilia ya sampuli ni chanya, na matokeo ya jaribio la jeni la nje ni chanya, ikionyesha kuwa DNA inayofaa kwa utambuzi wa kawaida wa PCR imetolewa kutoka kwa sampuli, na sampuli ya DNA ina jeni XXX.Majaribio ya uthibitishaji yanaweza kufanywa zaidi.
Hatua ya 8: Viunzi vya ugunduzi wa muundo
Baada ya jaribio, tumia 2% ya suluji ya hipokloriti ya sodiamu na 70% ya ethanoli kufuta eneo la majaribio ili kuzuia uchafuzi wa mazingira.
Nyongeza
Jedwali 2. Vipimo vya kawaida vinavyotumika kwa utambuzi wa jumla wa PCR wa mimea iliyobadilishwa vinasaba
Hati ya marejeleo:
SN/T 1202-2010, Mbinu ya kutambua ubora wa PCR kwa viambato vya mimea vilivyobadilishwa vinasaba katika chakula.
Tangazo la Wizara ya Kilimo 1485-5-2010, Upimaji wa viungo vya mimea iliyobadilishwa vinasaba na bidhaa zao-mchele M12 na derivatives yake.
Muda wa kutuma: Juni-09-2021
