Kama mpya katika maabara, si kazi nzuri kuchunguza mimea chanya kutoka kwa kundi la mimea yenye kiwango cha chini cha ubadilishaji.Kwanza, DNA lazima itolewe kutoka kwa idadi kubwa ya sampuli moja baada ya nyingine, na kisha jeni za kigeni zitagunduliwa na PCR.Hata hivyo, matokeo mara nyingi huwa tupu na mikanda yenye vipengee vichache mara kwa mara, lakini haiwezekani kubainisha ikiwa kuna ugunduzi ambao haujakamilika au ugunduzi wa uwongo..Je, ni hoi sana kukabiliana na mchakato kama huu wa majaribio na matokeo?Usijali, ndugu anakufundisha jinsi ya kuchunguza mimea chanya isiyobadilika kwa urahisi na kwa usahihi.

Hatua ya 1

Vitangulizi vya utambuzi wa muundo

Amua jeni asilia na jeni ya nje ya kutambuliwa kulingana na sampuli ya kujaribiwa, na uchague kiwakilishi cha mfululizo wa 100-500bp katika jeni kwa muundo wa kitangulizi.Vitangulizi vyema vinaweza kuhakikisha usahihi wa matokeo ya ugunduzi na kufupisha muda wa ugunduzi (angalia kiambatisho cha vianzilishi vya utambuzi vinavyotumika kawaida).

Notisi:Vianzilishi vipya vilivyoundwa vinahitaji kuboresha hali ya athari na kuthibitisha usahihi, usahihi na kikomo cha ugunduzi wa ugunduzi kabla ya kugunduliwa kwa kiwango kikubwa.

Hatua ya 2

Tengeneza itifaki ya majaribio

Udhibiti chanya: Tumia DNA iliyosafishwa iliyo na kipande kinacholengwa kama kiolezo ili kubainisha kama mfumo na masharti ya PCR ni ya kawaida.

Udhibiti hasi/tupu: Tumia kiolezo cha DNA au ddH2O ambacho hakina kipande kinacholengwa kama kiolezo ili kugundua kama kuna chanzo cha uchafuzi katika mfumo wa PCR.

Udhibiti wa ndani wa marejeleo: tumia kitangulizi/kichunguzi cha mchanganyiko wa jeni asilia ya sampuli ili kujaribiwa ili kutathmini ikiwa kiolezo kinaweza kutambuliwa na PCR.

Notisi:

Vidhibiti chanya, hasi/tupu na vidhibiti vya udhibiti wa ndani vinapaswa kuwekwa kwa kila jaribio ili kutathmini uhalali wa matokeo ya majaribio.

Maandalizi ya majaribio

Kabla ya matumizi, angalia ikiwa suluhisho limechanganywa sawasawa.Ikiwa mvua imepatikana, inahitaji kufutwa na kuchanganywa kulingana na maagizo kabla ya matumizi.Mchanganyiko wa 2×PCR unahitaji kupigwa bomba na kuchanganywa mara kwa mara na micropipette kabla ya matumizi ili kuzuia usambazaji usio sawa wa ioni.

Notisi:

Toa mwongozo na uisome kwa uangalifu, na ufanye maandalizi kabla ya jaribio kwa mujibu wa mahitaji ya mwongozo.

Hatua ya 4

Andaa mfumo wa majibu ya PCR

Kulingana na itifaki ya majaribio, changanya vianzio, H2O, na 2×PCR changanya kwa usawa, centrifuge na usambaze kwa kila bomba la majibu.

Notisi:

Kwa upimaji wa kiwango kikubwa au cha muda mrefu, inashauriwa kutumia mfumo wa mmenyuko wa PCR ulio na enzyme ya UNG, ambayo inaweza kuzuia kwa ufanisi uchafuzi wa erosoli unaosababishwa na bidhaa za PCR.

Hatua ya 5

Ongeza kiolezo cha majibu

Kwa kutumia teknolojia ya Direct PCR, hakuna haja ya mchakato wa kuchosha wa utakaso wa asidi ya nukleiki, kiolezo cha sampuli kinaweza kutayarishwa ndani ya dakika 10, na mfumo unaolingana wa majibu wa PCR unaweza kuongezwa.

Notisi:

Mbinu ya cleavage ina athari bora ya kugundua, na bidhaa iliyopatikana inaweza kutumika kwa athari nyingi za utambuzi.

5.1: Upanuzi wa moja kwa moja wa majani

Kwa mujibu wa ukubwa wa picha katika mwongozo, kata kitambaa cha jani na kipenyo cha 2-3mm na kuiweka kwenye mfumo wa majibu ya PCR.

Kumbuka: Hakikisha kwamba vipande vya majani vimetumbukizwa kabisa kwenye suluhisho la mmenyuko wa PCR, na usiongeze tishu nyingi za majani.

5.2: Mbinu ya mgawanyiko wa majani

Kata kitambaa cha jani na kipenyo cha 5-7mm na kuiweka kwenye tube ya centrifuge.Ikiwa unachagua majani yaliyoiva, tafadhali epuka kutumia tishu za mshipa mkuu wa jani.Pipette 50ul Buffer P1 lysate kwenye bomba la centrifuge ili kuhakikisha kwamba lysate inaweza kuzama kabisa tishu za jani, kuiweka kwenye mzunguko wa joto au umwagaji wa chuma, na lyse kwa 95 ° C kwa dakika 5-10.

Ongeza 50ul Buffer P2 ufumbuzi wa neutralization na kuchanganya vizuri.Lisate inayotokana inaweza kutumika kama kiolezo na kuongezwa kwa mfumo wa majibu ya PCR.

Kumbuka: Kiasi cha template ni kati ya 5-10% ya mfumo wa PCR, na haipaswi kuzidi 20% (kwa mfano, katika mfumo wa 20μl PCR, ongeza 1-2μl ya ufumbuzi wa lysis, si zaidi ya 4μl).

Hatua ya 6

Mwitikio wa PCR

Baada ya kuweka katikati bomba la majibu la PCR, huwekwa kwenye kifaa cha PCR kwa ukuzaji.

Notisi:

Mwitikio hutumia kiolezo kisichotakaswa kwa ukuzaji, kwa hivyo idadi ya mizunguko ya ukuzaji ni mizunguko 5-10 zaidi kuliko wakati wa kutumia kiolezo cha DNA iliyosafishwa.

Hatua ya 7

Utambuzi wa electrophoresis na uchambuzi wa matokeo

M: Ngazi ya DNA ya 100bp

1\4: Mbinu ya DNA iliyosafishwa

2\5: Mbinu ya PCR ya moja kwa moja

3\6: Udhibiti tupu

QC:

Matokeo ya majaribio ya vidhibiti mbalimbali vilivyowekwa katika jaribio yanafaa kutimiza masharti yafuatayo.Vinginevyo, sababu ya tatizo inapaswa kuchambuliwa, na mtihani unapaswa kufanywa tena baada ya tatizo kuondolewa.

Jedwali 1. Matokeo ya mtihani wa kawaida wa vikundi mbalimbali vya udhibiti

*Plamidi inapotumika kama kidhibiti chanya, matokeo ya mtihani wa jeni asilia yanaweza kuwa hasi

Hukumu ya matokeo:

A. Matokeo ya jaribio la jeni asilia ya sampuli ni hasi, ikionyesha kuwa DNA inayofaa kwa utambuzi wa kawaida wa PCR haiwezi kutolewa kutoka kwa sampuli au DNA iliyotolewa ina vizuizi vya athari ya PCR, na DNA inapaswa kutolewa tena.

B. Matokeo ya jaribio la jeni asilia ya sampuli ni chanya, na matokeo ya mtihani wa jeni ya nje ni hasi, ikionyesha kuwa DNA inayofaa kwa utambuzi wa kawaida wa PCR imetolewa kutoka kwa sampuli, na inaweza kutathminiwa kuwa jeni la XXX halijatambuliwa kwenye sampuli.

C. Matokeo ya jaribio la jeni asilia ya sampuli ni chanya, na matokeo ya jaribio la jeni la nje ni chanya, ikionyesha kuwa DNA inayofaa kwa utambuzi wa kawaida wa PCR imetolewa kutoka kwa sampuli, na sampuli ya DNA ina jeni ya XXX.Majaribio ya uthibitishaji yanaweza kufanywa zaidi.

Hatua ya 8

Vitangulizi vya utambuzi wa muundo

Baada ya jaribio, tumia 2% ya suluji ya hipokloriti ya sodiamu na 70% ya ethanoli kufuta eneo la majaribio ili kuzuia uchafuzi wa mazingira.