COVID-19 ni ugonjwa wa kuambukiza unaosababishwa na Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2. Mtu anapoambukizwa, dalili zinazojulikana zaidi ni homa, kikohozi, na upungufu wa kupumua.

Sampuli zinazotumiwa kupima zinaweza kukusanywa na swabs za nasopharyngeal au swabs za oropharyngeal.

PCR ni nini?

Njia ya kawaida ya kugundua coronavirus ni mmenyuko wa mnyororo wa polymerase, PCR.Hii ni njia inayotumika sana katika biolojia ya molekuli.Inaweza kunakili haraka mamilioni kwa mabilioni ya vipande maalum vya DNA.

Coronavirus mpya ina jenomu ndefu sana ya safu moja ya RNA.Ili kugundua virusi hivi kwa PCR, molekuli za RNA lazima zigeuzwe kuwa mfuatano wao wa DNA kwa reverse transcriptase, kisha DNA iliyosanisishwa mpya inaweza kuimarishwa kwa taratibu za kawaida za PCR, ambazo kwa kawaida hujulikana kama RT-PCR.

Mchakato wa RT-PCR

Uchimbaji wa RNA

Ili kufanya njia hii, RNA ya virusi inapaswa kimsingi kutolewa.Seti mbalimbali za utakaso wa RNA zinaweza kutumika kwa utengano unaofaa, wa haraka na unaofaa.

Ili kutoa RNA ya virusi kwa kutumia vifaa vya kibiashara, kwanza ongeza sampuli kwenye bomba la microcentrifuge na kisha uchanganye na bafa ya lysis.Bafa hii ina asili ya hali ya juu na kwa kawaida huwa na phenoli na guanidine isothiocyanate.Kwa kuongeza, vizuizi vya RNase kwa kawaida huwa katika bafa ya lysis ili kuhakikisha kutengwa kwa RNA ya virusi isiyoharibika.

Baada ya kuongeza bafa ya lysis, pindua bomba la kuchanganya kwa mapigo na uangushe kwenye joto la kawaida.Kisha virusi hutawanywa chini ya hali ya kubadilika sana inayotolewa na bafa ya lysis.

Baada ya sampuli ni lysed, tube centrifuge hutumiwa kwa utaratibu wa utakaso.Sampuli hupakiwa kwenye bomba la centrifuge na kisha kuingizwa.

Utaratibu huu ni njia dhabiti ya uchimbaji wa awamu ambayo awamu ya kusimama ina matrix ya gel ya silika.

Chini ya hali bora ya chumvi na pH, molekuli za RNA hufunga kwenye utando wa silika.

Wakati huo huo, protini na uchafu mwingine huondolewa.

Baada ya kusawazisha, weka bomba la centrifuge kwenye bomba safi la mkusanyiko, tupa kichungi, na kisha ongeza bafa ya kuosha.

Weka bomba kwenye centrifuge tena ili kulazimisha bafa ya safisha kupitia membrane.Hii itaondoa uchafu wote uliobaki kutoka kwa membrane, na kuacha tu RNA iliyofungwa kwenye gel ya silika.

Baada ya sampuli kuosha, weka bomba kwenye bomba la microcentrifuge safi na uongeze bafa ya elution.

Kisha inawekwa katikati ili kulazimisha bafa ya elution kupitia utando.Bafa ya elution huondoa RNA ya virusi kutoka kwa safu wima na kupata RNA iliyosafishwa isiyo na protini, vizuizi na uchafu mwingine.

HATUA YA 2

Kuzingatia mchanganyiko

Baada ya kutoa RNA ya virusi, hatua inayofuata ni kuandaa mchanganyiko wa majibu kwa ukuzaji wa PCR.Katika hatua hii, mkusanyiko hutumiwa.Suluhisho hili lililokolea ni suluhu iliyochanganywa iliyochanganywa inayojumuisha mchanganyiko wa awali, nakala ya nyuma, nukleotidi, kitangulizi cha mbele, kitangulizi cha nyuma, uchunguzi wa TaqMan na polimerasi ya DNA.

Hatimaye, ili kukamilisha mchanganyiko huu wa majibu, kiolezo cha RNA kinaongezwa.Mirija huchanganyika na kupigwa kwa mapigo, na kisha mchanganyiko wa majibu hupakiwa kwenye sahani ya PCR.Sahani ya PCR huwa na visima 96 na inaweza kuchanganua sampuli nyingi kwa wakati mmoja.

HATUA YA 3

Ukuzaji wa PCR

Ifuatayo, weka sahani kwenye mashine ya PCR, ambayo kimsingi ni kiendesha mzunguko wa joto.

RT-PCR ya wakati halisi hutumika kugundua virusi vya korona vya 2019 kwa kukuza mlolongo unaolengwa katika jeni la RdrRP, jeni la E na jeni la N.Uchaguzi wa jeni la lengo hutegemea mlolongo wa primer na probe.

Hatua ya kwanza ya RT-PCR ni unukuzi wa kinyume.Kamba ya kwanza ya DNA inayosaidia imeunganishwa, ambayo imeanzishwa na msingi wa nyuma wa PCR, ambao hufunga kwa sehemu ya ziada ya jenomu ya virusi ya RNA.Kisha reverse transcriptase huongeza nyukleotidi za DNA kwenye 3′mwisho wa primer ili kuunganisha DNA inayosaidiana na virusi vya RNA.Halijoto na muda wa hatua hii hutegemea vianzio, RNA lengwa, na nakala ya nyuma inayotumika.

Ifuatayo, hatua ya awali ya denaturation inatumiwa, ambayo inasababisha kubadilika kwa mseto wa RNA-DNA.Hatua hii ni muhimu ili kuwezesha DNA polymerase.Wakati huo huo, reverse transcriptase imezimwa.

PCR inajumuisha mfululizo wa mizunguko ya joto.Kila mzunguko unajumuisha hatua za denaturation, annealing na upanuzi.

Hatua ya urekebishaji inahusisha kupasha joto chemba ya athari hadi nyuzi joto 95 Selsiasi na kuitumia kugeuza kiolezo cha DNA chenye ncha mbili.

Katika hatua inayofuata, halijoto ya mmenyuko hupunguzwa hadi nyuzi joto 58 Selsiasi, na kuruhusu kitangulizi cha mbele kuungana na sehemu inayosaidia ya kiolezo chake cha DNA chenye ncha moja.Joto la annealing moja kwa moja inategemea urefu na muundo wa primer.

Katika hatua ya upanuzi, polimerasi ya DNA husanikisha uzi mpya wa DNA unaosaidiana na uzi wa kiolezo cha DNA.Kwa kuongeza viini vya bure vinavyosaidiana na kiolezo katika mwelekeo wa 5 hadi 3 kutoka kwa mchanganyiko wa majibu.Joto la hatua hii inategemea polymerase ya DNA iliyotumiwa.

Baada ya mzunguko wa kwanza, lengo la DNA mbili-stranded linapatikana.

Kisha, ingiza mzunguko wa pili.DNA yenye nyuzi mbili imebadilishwa ili kutoa molekuli mbili za DNA zenye nyuzi moja.

Katika hatua inayofuata, halijoto ya mmenyuko hupunguzwa, vianzio vinaunganishwa kwa kila kiolezo cha DNA chenye ncha moja, na uchunguzi wa Taq-man huunganishwa kwenye sehemu inayosaidia ya DNA inayolengwa.

Uchunguzi wa TaqMan una fluorophore iliyounganishwa kwa ushirikiano na 5′mwisho wa uchunguzi wa oligonucleotide.Inaposisimka na chanzo cha mwanga cha mzunguko, fluorophore hutoa fluorescence.Kwa kuongeza, uchunguzi unajumuisha quencher mwishoni mwa 3.Ukaribu wa jeni la mwandishi wa habari kwa kizima huzuia ugunduzi wa fluorescence.

Katika hatua ya upanuzi, polimerasi ya DNA inaunganisha uzi mpya.Polimasi inapofika kwenye uchunguzi wa TaqMan, shughuli yake ya asili ya 5′nuclease hupasua uchunguzi, ikitenganisha rangi kutoka kwa kizima.

Kwa kila mzunguko wa PCR, molekuli nyingi za rangi hutolewa, na kusababisha ongezeko la kiwango cha fluorescence sawia na idadi ya amplikoni zilizounganishwa.

Njia hii inaruhusu kukadiria idadi ya mlolongo fulani uliopo kwenye sampuli.Idadi ya vipande vya DNA vyenye nyuzi mbili huongezeka maradufu katika kila mzunguko.Kwa hiyo, PCR inaweza kutumika kuchambua sampuli ndogo sana.

Kwa ajili ya kupima mawimbi ya umeme, taa ya halojeni ya tungsten, kichujio cha msisimko, kiakisi, lenzi, kichujio cha uzalishaji na chaji ya kamera ya CCD inayotumia kifaa.

HATUA YA 4 Tambua

Kwa ajili ya kupima mawimbi ya umeme, taa ya halojeni ya tungsten, kichujio cha msisimko, kiakisi, lenzi, kichujio cha uzalishaji na chaji ya kamera ya CCD inayotumia kifaa.

Nuru iliyochujwa kutoka kwenye taa inaonyeshwa na kutafakari, inapita kupitia lens ya condenser, na inalenga katikati ya kila shimo.Kisha fluorescence iliyotolewa kutoka kwenye shimo inaonekana kutoka kioo, inapita kupitia chujio cha chafu, na hugunduliwa na kamera ya CCD.Katika kila mzunguko wa PCR, mwanga wa fluorophore unaojifurahisha unaweza kugunduliwa na CCD.

Inabadilisha mwanga ulionaswa kuwa data ya kidijitali.Njia hii inaitwa PCR ya wakati halisi, na inaruhusu ufuatiliaji wa wakati halisi wa maendeleo ya majibu ya PCR.