PCR (polymerase chain reaction) ni mojawapo ya teknolojia za ukuzaji wa DNA ndani ya vitro, yenye historia ya zaidi ya miaka 30.

Teknolojia ya PCR ilianzishwa na Kary Mullis wa Cetus, Marekani mwaka wa 1983. Mullis aliomba hataza ya PCR mwaka wa 1985 na kuchapisha karatasi ya kwanza ya kitaaluma ya PCR kuhusu Sayansi mwaka huo huo.Mullis alitunukiwa Tuzo ya Nobel ya Kemia mwaka wa 1993 kwa kazi yake.

Kanuni za Msingi za PCR

PCR inaweza kukuza vipande lengwa vya DNA kwa zaidi ya mara milioni moja.Kanuni hiyo iko chini ya uchanganuzi wa polimerasi ya DNA, kwa kutumia DNA ya uzi wa mzazi kama kiolezo na kianzio mahususi kama mahali pa kuanzia kwa upanuzi.Inaigwa kwa njia ya vitro kupitia hatua kama vile urekebishaji, ufupishaji, na upanuzi.Mchakato wa DNA ya uzi wa binti inayosaidiana na DNA ya kiolezo cha uzi wa mzazi.

Mchakato wa kawaida wa PCR umegawanywa katika hatua tatu:

1.Denaturation: Tumia halijoto ya juu kutenganisha nyuzi mbili za DNA.Kifungo cha hidrojeni kati ya nyuzi mbili za DNA huvunjika kwa joto la juu (93-98℃).

2.Annealing: Baada ya DNA ya nyuzi mbili kutenganishwa, punguza joto ili primer iweze kushikamana na DNA ya kamba moja.

3.Upanuzi: Polimerasi ya DNA huanza kuunganisha nyuzi zinazosaidiana kwenye nyuzi za DNA kutoka kwa vianzio vinavyofungwa wakati halijoto inapungua.Wakati ugani umekamilika, mzunguko umekamilika, na idadi ya vipande vya DNA huongezeka mara mbili

Kurudia hatua hizi tatu mara 25-35, idadi ya vipande vya DNA itaongezeka kwa kasi.

Ustadi wa PCR ni kwamba vianzilishi tofauti vinaweza kuundwa kwa jeni tofauti lengwa, ili vipande vya jeni vinavyolengwa viweze kukuzwa kwa muda mfupi.

Hadi sasa, PCR inaweza kugawanywa katika makundi matatu, yaani PCR ya kawaida, PCR ya kiasi cha fluorescent na PCR ya digital.

Kizazi cha kwanza cha PCR ya kawaida

Tumia kifaa cha kawaida cha ukuzaji cha PCR ili kukuza jeni inayolengwa, na kisha utumie elektrophoresis ya gel ya agarose kugundua bidhaa, uchambuzi wa ubora pekee unaweza kufanywa.

Hasara kuu za PCR ya kizazi cha kwanza:

1.Kukabiliwa na ukuzaji usio maalum na matokeo chanya ya uwongo.

2.Ugunduzi huchukua muda mrefu na operesheni ni ngumu.

3.Jaribio la ubora pekee linaweza kufanywa

PCR ya Kizazi cha Pili ya Wakati Halisi

PCR ya Wakati Halisi, pia inajulikana kama qPCR, hutumia vichunguzi vya umeme ambavyo vinaweza kuonyesha maendeleo ya mfumo wa athari, na hufuatilia mkusanyiko wa bidhaa zilizoimarishwa kupitia mkusanyiko wa ishara za fluorescent, na kutathmini matokeo kupitia mkondo wa fluorescence.Inaweza kuhesabiwa kwa msaada wa thamani ya Cq na curve ya kawaida.

Kwa sababu teknolojia ya qPCR inafanywa katika mfumo funge, uwezekano wa uchafuzi hupunguzwa, na mawimbi ya umeme yanaweza kufuatiliwa ili kugunduliwa kwa kiasi, kwa hivyo ndiyo inayotumika sana katika mazoezi ya kliniki na imekuwa teknolojia inayotawala katika PCR.

Dutu za umeme zinazotumiwa katika kiasi halisi cha umeme cha PCR zinaweza kugawanywa katika: Kichunguzi cha umeme cha TaqMan, vinara wa molekuli na rangi ya fluorescent.

1) Uchunguzi wa umeme wa TaqMan:

Wakati wa kukuza PCR, uchunguzi maalum wa fluorescent huongezwa wakati wa kuongeza jozi ya primer.Uchunguzi ni oligonucleotide, na ncha zote mbili zimeandikwa na kikundi cha fluorescent cha mwandishi na kikundi cha fluorescent ya quencher.

Wakati uchunguzi umekamilika, ishara ya umeme iliyotolewa na kikundi cha waandishi wa habari inachukuliwa na kikundi cha kuzima;wakati wa ukuzaji wa PCR, shughuli ya exonuclease ya 5'-3′ ya kimeng'enya cha Taq hupasuka na kuharibu uchunguzi, na kufanya mwandishi wa kikundi cha fluorescent na kuzima Kikundi cha fluorescent kinatenganishwa, ili mfumo wa ufuatiliaji wa umeme uweze kupokea ishara ya fluorescence, yaani, kila wakati kamba ya DNA inapoundwa, kuongezeka kwa fluorescent, na kuongezeka kwa fluorescence. ishara imelandanishwa kabisa na uundaji wa bidhaa ya PCR.

2) rangi ya umeme ya SYBR:

Katika mfumo wa mmenyuko wa PCR, ziada ya rangi ya fluorescent ya SYBR huongezwa.Baada ya rangi ya fluorescent ya SYBR kuingizwa bila kuingizwa mahususi kwenye nyuzi mbili za DNA, hutoa ishara ya fluorescent.Molekuli ya rangi ya SYBR ambayo haijajumuishwa kwenye mnyororo haitatoa mawimbi yoyote ya umeme, na hivyo kuhakikisha mawimbi ya umeme Ongezeko la bidhaa za PCR linasawazishwa kabisa na ongezeko la bidhaa za PCR.SYBR hufunga kwa DNA yenye ncha mbili pekee, kwa hivyo mduara wa kuyeyuka unaweza kutumika kubainisha kama majibu ya PCR ni mahususi.

3) Mwanga wa molekuli:

Ni probe ya oligonucleotide yenye kitanzi cha shina yenye lebo mbili ambayo huunda muundo wa pini ya nywele wa besi 8 hivi kwenye ncha 5 na 3.Mifuatano ya asidi ya nuklei kwenye ncha zote mbili imeunganishwa kwa usawa, na kusababisha kikundi cha fluorescent na kikundi cha kuzimisha kuwa ngumu.Funga, hakuna fluorescence itatolewa.

Baada ya bidhaa ya PCR kuzalishwa, wakati wa mchakato wa annealing, sehemu ya kati ya mwanga wa molekuli huunganishwa na mlolongo maalum wa DNA, na jeni la fluorescent hutenganishwa na jeni la quencher ili kuzalisha fluorescence.

Hasara kuu za PCR ya kizazi cha pili:

Unyeti bado haupo, na ugunduzi wa vielelezo vya nakala ya chini sio sahihi.

Kuna ushawishi wa thamani ya usuli, na matokeo yake yanaweza kuingiliwa.

Wakati kuna vizuizi vya PCR katika mfumo wa majibu, matokeo ya ugunduzi yanaweza kuingiliwa.

Kizazi cha tatu cha PCR ya kidijitali

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) hukokotoa nambari ya nakala ya mfuatano lengwa kupitia ugunduzi wa sehemu ya mwisho, na inaweza kufanya utambuzi sahihi wa kiasi bila kutumia vidhibiti vya ndani na mikunjo ya kawaida.

Digital PCR hutumia utambuzi wa mwisho na haitegemei thamani ya Ct (kiwango cha juu cha mzunguko), kwa hivyo athari ya PCR ya dijiti huathiriwa kidogo na ufanisi wa ukuzaji, na ustahimilivu wa vizuizi vya majibu ya PCR huboreshwa, kwa usahihi wa hali ya juu na kuzaliana.

Kwa sababu ya sifa za unyeti wa hali ya juu na usahihi wa hali ya juu, haiingiliwi kwa urahisi na vizuizi vya mmenyuko wa PCR, na inaweza kufikia ujanibishaji kamili wa kweli bila bidhaa za kawaida, ambazo zimekuwa hotspot ya utafiti na matumizi.

Kulingana na aina tofauti za kitengo cha majibu, inaweza kugawanywa katika aina tatu kuu: microfluidic, chip na mifumo ya droplet.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Kulingana na teknolojia ya microfluidic, template ya DNA imetenganishwa.Teknolojia ya microfluidic inaweza kutambua sampuli ya uboreshaji wa nano au uzalishaji wa matone madogo, lakini matone yanahitaji mbinu maalum ya utangazaji na kisha kuunganishwa na mfumo wa athari ya PCR.mdPCR imechukuliwa hatua kwa hatua na njia zingine badala.

2) PCR ya dijiti yenye msingi wa Droplet, ddPCR:

Tumia teknolojia ya kuzalisha matone ya maji-ndani ya mafuta ili kuchakata sampuli kuwa matone, na kugawanya mfumo wa majibu ulio na molekuli za asidi ya nukleiki katika maelfu ya matone ya nanoscale, ambayo kila moja haina molekuli inayolengwa ya asidi ya nyuklia ya kutambuliwa, au Ina moja hadi molekuli kadhaa zinazolengwa za asidi ya nuklei za kufanyiwa majaribio.

3) PCR ya dijiti yenye msingi wa Chip, cdPCR:

Tumia teknolojia iliyounganishwa ya njia ya kiowevu kuchonga vijitubu vingi na vijishimo kwenye kaki za silikoni au glasi ya quartz, na kudhibiti mtiririko wa suluhisho kupitia vali tofauti za udhibiti, na ugawanye kioevu cha sampuli katika nanomita za ukubwa sawa kwenye visima vya athari kwa Mwitikio wa PCR wa dijiti ili kufikia ujanibishaji kamili.

Hasara kuu za PCR ya kizazi cha tatu:

Vifaa na vitendanishi ni ghali.

Mahitaji ya ubora wa kiolezo ni ya juu.Ikiwa wingi wa template unazidi wingi wa microsystem, haitawezekana kuhesabu, na ikiwa ni ndogo sana, usahihi wa quantification utapunguzwa.

Chanya za uwongo pia zinaweza kuzalishwa wakati kuna ukuzaji usio mahususi.