PCR, nyingi PCR, Katika PCR, Badilisha PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Tutatatua dhana, hatua na maelezo ya PCR mbalimbali

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, inayojulikana kama PCR, ni teknolojia ya kibiolojia ya molekuli ambayo hutumiwa kupanua vipande maalum vya DNA.Inaweza kuzingatiwa kama nakala maalum ya DNA katika vitro.DNA polymerase (DNA Polymerase I) iligunduliwa mapema mwaka wa 1955, na Klenow Fragment ya E. Coli, ambayo ina thamani ya majaribio na vitendo, iligunduliwa na Dk H. Klenow mapema miaka ya 1970, lakini kwa sababu enzyme hii haivumilii joto, joto la juu linaweza kuiharibu, kwa hiyo haipatikani na mmenyuko wa mnyororo wa uharibifu wa polymerase.Enzymes zinazotumika leo (zinazoitwa Taq polymerase), zilitengwa na Thermus aquaticus, bakteria ya chemchemi ya moto mnamo 1976. Tabia yake ni kwamba inaweza kupinga joto la juu na ni kimeng'enya bora, lakini hutumiwa sana baada ya miaka ya 1980.Dhana ya awali ya mfano wa awali wa PCR ni sawa na kutengeneza na kunakili jeni, ambayo ilipendekezwa na Dk. KJell Kleppe mwaka wa 1971. Alichapisha nakala ya kwanza ya jeni rahisi na ya muda mfupi (sawa na athari za mzunguko wa kwanza wa PCR).PCR iliyotengenezwa leo ilitengenezwa na Dk. Kary B. Mullis mwaka wa 1983. Dk. Mullis alihudumia makampuni ya PE mwaka huo, hivyo PE ina hadhi maalum katika sekta ya PCR.Dk. Mullis alichapisha rasmi karatasi ya kwanza inayohusiana na Saiki na wengine mwaka wa 1985. Tangu wakati huo, matumizi ya PCR ni maelfu ya maili kwa siku, na ubora wa karatasi zinazohusiana unaweza kusemwa kufanya mbinu nyingine nyingi za utafiti kuwa zisizopendeza.Baadaye, teknolojia ya PCR inatumika sana katika utafiti wa kisayansi wa kibiolojia na matumizi ya kimatibabu, na kuwa teknolojia muhimu zaidi ya utafiti wa baiolojia ya molekuli.Mullis pia alishinda Tuzo ya Nobel ya Kemia ya 1993.

PCRKanuni

Kanuni ya msingi ya teknolojia ya PCR ni sawa na mchakato wa urudufishaji wa asili wa DNA, na umaalumu wake unategemea primer ya oligonucleotide ambayo ni nyongeza kwa ncha zote mbili za mlolongo unaolengwa.PCR inaundwa na kuzorota-kuongeza-kupanua hatua tatu za msingi za athari: ①Uharibifu wa DNA ya kiolezo: Baada ya DNA ya kiolezo kupashwa joto hadi takriban 93°C kwa muda fulani, suluhu la DNA mbili la DNA ya minyororo miwili linaloundwa na ukuzaji wa kiolezo cha PCR cha kiolezo Kuondoka, ili kukitengeneza kwa mnyororo mmoja unaofuata kukitengeneza.②Uwekaji (kiwanja) wa kiolezo cha DNA na kianzilishi: Baada ya DNA ya kiolezo kupashwa joto na kuharibika kuwa mnyororo mmoja, halijoto hushuka hadi takriban 55°C.Mfuatano wa ziada wa kitangulizi na kiolezo cha mnyororo mmoja wa DNA.③ Upanuzi wa kianzilishi: kiolezo cha DNA-kiunganishi cha kianzilishi kinatokana na kitendo cha TaqDNA polimasi, na dNTP kama malighafi ya mmenyuko.Weka kanuni ya urudufishaji, unganisha msururu mpya wa nakala uliohifadhiwa nusu ambao unasaidiana na msururu wa DNA wa kiolezo, na kurudia michakato ya tatu ya kuzorota-upunguzaji-upanuzi wa mzunguko inaweza kupata "msururu wa nakala uliohifadhiwa nusu", na msururu huu mpya unapatikana tena Kuwa kiolezo cha mzunguko unaofuata.Inachukua 2-4min kukamilisha kitanzi, jeni inayolengwa inaweza kukuzwa mara milioni kadhaa katika masaa 2-3.

KawaidaPCRMfumo wa Majibu

Vipengele vitano vya mmenyuko wa PCR

Kuna hasa aina tano za dutu zinazohusika katika mmenyuko wa PCR, ambazo ni primer, kimeng'enya, dNTP, kiolezo na bafa (Mg2+ inahitajika).[Utaratibu wa PCR]

Mchakato wa kawaida wa PCR umegawanywa katika hatua tatu

1. Uharibifu wa DNA (90°C-96°C): Violezo vya DNA vya minyororo miwili chini ya hatua ya joto, vifungo vya hidrojeni hukatika, na kutengeneza DNA ya mnyororo mmoja.

2. Ufungaji (25℃ -65℃): Halijoto ya mfumo imepunguzwa, primer inaunganishwa na kiolezo cha DNA ili kuunda msururu wa pande mbili.

3. Upanuzi (70℃ -75℃): Chini ya utendakazi wa kimeng'enya cha Taq (takriban 72°C, shughuli bora zaidi), dNTP hutumiwa kama malighafi, kupanua kutoka mwisho wa 5′ wa kitangulizi → 3′ mwisho, usanisi na kiolezo hukamilishana mnyororo wa DNA.

Kila mzunguko umepunguzwa, kupunguzwa na kupanuliwa, na kuongeza maudhui ya DNA mara mbili.Kwa sasa, kutokana na eneo fupi la ukuzaji, baadhi ya PCR inaweza kuigwa kwa muda mfupi sana hata ikiwa shughuli ya enzyme ya Taq sio bora, kwa hiyo inaweza kubadilishwa kwa hatua mbili, yaani, annealing na ugani unaweza kufanywa kwa 60 ° C-65 ° C kwa wakati mmoja.Ili kupunguza mchakato wa kuinua na baridi na kuboresha kasi ya majibu.

Vipengele vya Majibu ya PCR

● Umaalumu wa Juu

Vipengele mahususi vya uamuzi wa jibu la PCR ni: ①Mchanganyiko mahususi wa kianzio na DNA ya kiolezo.② Kanuni ya kuoanisha msingi.③Uaminifu wa majibu ya awali ya polimerasi ya TaqDNA.④ Umaalum na uhafidhina wa jeni lengwa.

Mchanganyiko sahihi wa primers na templates ni muhimu.Kufunga kwa primer na kiolezo na upanuzi wa mnyororo wa msingi hutegemea kanuni ya kulinganisha msingi wa alkali.Uaminifu wa miitikio ya usanisi ya polimerasi na ukinzani wa halijoto ya juu wa polima ya Taq DNA ili kufanya kuunganisha (kiwanja) cha kiolezo na kitangulizi katika mmenyuko kunaweza kufanywa kwa joto la juu.Maalum ya mchanganyiko huongezeka sana.Klipu inaweza kudumisha kiwango cha juu cha usahihi.Kwa kuchagua eneo linalolengwa la kijeni lenye uhafidhina wa hali ya juu na uhifadhi wa hali ya juu, umaalum wake ni wa juu zaidi.

● Unyeti wa Juu

Kiasi cha uzalishaji wa bidhaa za PCR kinaongezeka kwa index, ambayo inaweza kupanua template ya kuanzia ya Picker (PG=10-12) ili kuongeza kiwango cha microcontroller kwa kiwango cha micrograms (μg= -6).Seli zinazolengwa zinaweza kutambuliwa kutoka kwa seli milioni 1;katika kugundua virusi, unyeti wa PCR unaweza kufikia 3 RFUs (vitengo tupu vilivyoundwa);kiwango cha chini cha kugundua katika sayansi ya bakteria ni bakteria 3.

● Rahisi na Haraka

Tafakari ya PCR hutumia polimerasi ya Taq DNA ya halijoto ya juu, ambayo huongeza majibu ya majibu kwa wakati mmoja, yaani, mmenyuko wa upanuzi wa kuzorota-anneal kwenye suluhisho la ukuzaji wa DNA na sufuria ya kuoga maji.Kwa ujumla, mmenyuko wa ukuzaji hukamilika baada ya masaa 2 hadi 4.Bidhaa zilizoimarishwa kwa ujumla huchanganuliwa kwa upanga wa umeme, na sio lazima kutumia isotopu, hakuna uchafuzi wa mionzi, na utangazaji rahisi.

● Usafi wa sampuli ni mdogo

Hakuna haja ya kutenganisha virusi au bakteria na seli za utamaduni.Bidhaa ghafi za DNA na RNA zinaweza kutumika kama vikuza sauti.Ugunduzi wa ukuzaji wa DNA unaweza kutumika moja kwa moja kwa kutumia vielelezo vya kimatibabu kama vile damu, kioevu cha mwili, maji ya kuosha kikohozi, nywele, seli na tishu hai.

PCRmatatizo ya kawaida

● Uongo hasi, hakuna bendi zilizokuzwa

Hatua muhimu za mmenyuko wa PCR ni pamoja na: ① maandalizi ya kiolezo cha asidi nucleiki, ② ubora na umaalum wa vianzio, ③ ubora wa vimeng'enya ④ hali ya mzunguko wa PCR.Kupata sababu inapaswa pia kuchambuliwa na kusoma kwa viungo hapo juu.

Violezo: ① Kiolezo kina protini mbalimbali, ② Kiolezo kina kizuia kimeng'enya cha Taq, ③ Protini iliyo kwenye kiolezo haijaondolewa, hasa protini ya kikundi katika kromosomu.⑤ Upungufu wa asidi ya nukleiki ya deminer si kamili.Wakati ubora wa enzymes na primers ni nzuri, hakuna bendi ya amplification, ambayo ni uwezekano mkubwa wa matibabu ya utumbo wa vielelezo.Kuna kitu kibaya na mchakato wa uchimbaji wa asidi ya nucleic ya template, kwa hivyo ili kuandaa suluhisho la digestion la ufanisi na thabiti, utaratibu wake unapaswa kurekebishwa na usibadilishwe kiholela.

Kuamilishwa kwa kimeng'enya: kimeng'enya kipya au vimeng'enya vyote viwili vya zamani na vipya vinapaswa kutumiwa pamoja kuchanganua ikiwa shughuli ya kimeng'enya imepotea au haitoshi, na hivyo kusababisha hasi za uwongo.Ikumbukwe kwamba Taq enzyme au ethidiamu bromidi wakati mwingine husahaulika.

Primer: ubora wa primer, mkusanyiko wa primer, na kama mkusanyiko wa primer mbili ni ulinganifu.Ni sababu ya kawaida ya kushindwa kwa PCR au bendi inayoongezeka sio bora na inakabiliwa na kuenea.Kuna matatizo na ubora wa primers ya baadhi ya idadi ya kundi.Vitambulisho viwili vina mkusanyiko wa juu na ukolezi mdogo, na kusababisha amplification ya chini ya ufanisi wa asymmetric.Hatua za kukabiliana ni: ① Chagua kitangulizi kizuri cha kuunganisha vitengo.② Mkusanyiko wa primer hautegemei tu thamani ya OD, lakini pia huzingatia kioevu cha awali cha primer ili kufanya electrophoresis ya gel ya sukari ya agar.Lazima kuwe na ukanda wa sehemu ya kwanza, na mwangaza wa vianzio viwili unapaswa kuwa thabiti kwa ujumla.Ukanda, PCR inaweza kushindwa kwa wakati huu, na inapaswa kutatuliwa na kitengo cha awali cha usanisi.Ikiwa primer ni ya juu, mwangaza ni mdogo, na ukolezi wake lazima uwe na usawa wakati wa diluted.③ Primer inapaswa kulipwa na kuhifadhiwa katika mkusanyiko wa juu ili kuzuia sehemu nyingi za kufungia au za muda mrefu za jokofu, ambayo itasababisha primer kuharibika na kuharibika.④ Muundo wa kitangulizi haukubaliki, kama vile urefu wa kitangulizi hautoshi, na nguzo ya di inaundwa kati ya vianzio.

Ukolezi wa Mg2+: ukolezi wa Mg2+ion una athari kubwa kwa ufanisi wa ukuzaji wa PCR.Kuzingatia kupita kiasi kunaweza kupunguza jinsia tofauti ya ukuzaji wa PCR.Ikiwa mkusanyiko ni wa chini sana, pato la ukuzaji wa PCR litafanya hata kushindwa kwa ukuzaji wa PCR bila bendi ya upanuzi.

Mabadiliko ya kiasi cha majibu: Kiasi kinachotumika katika ukuzaji wa PCR ni 20ul, 30ul, na 50ul au 100uL, kiasi kikubwa cha maombi ya ukuzaji wa PCR huwekwa kulingana na madhumuni tofauti ya utafiti wa kisayansi na majaribio ya kimatibabu.Baada ya kufanya kiasi kidogo kama vile 20ul, ni muhimu kufanya hali ya kamba wakati wa kufanya ukubwa, vinginevyo itashindwa.

Sababu za kimwili: Mabadiliko ni muhimu sana kwa ukuzaji wa PCR.Ikiwa hali ya joto ya uharibifu ni ya chini, muda wa uharibifu ni mfupi, inawezekana kutokea katika hasi za uongo;halijoto ya chini sana ya annealing inaweza kusababisha ukuzaji usio maalum na kupunguza ufanisi maalum wa ukuzaji.Inaathiri sana mchanganyiko wa vianzio na violezo ili kupunguza ufanisi wa ukuzaji wa PCR.Wakati mwingine ni muhimu kutumia vipimajoto vya kawaida ili kuchunguza kutofautiana, annealing na joto la kupanuliwa katika jiko la ugani au maji-mumunyifu, ambayo ni moja ya sababu za kushindwa kwa PCR.

Vibadala vya mfuatano unaolengwa: Ikiwa mfuatano unaolengwa utatokea, mabadiliko au ufutaji, mseto wa mfano na kiolezo utaunganishwa, au kwa sababu ya ukosefu wa mfuatano lengwa, kitangulizi na kiolezo kitapoteza mfuatano unaosaidiana, na ukuzaji wake wa PCR hautafaulu.

● Uongo chanya

Mkanda wa ukuzaji wa PCR huonekana kuendana na mkanda unaolengwa wa mfuatano, na wakati mwingine bendi yake huwa nadhifu zaidi na ya juu zaidi.

Muundo wa kwanza haufai: mfuatano uliochaguliwa wa ukuzaji na mfuatano wa ukuzaji usio na kusudi unafanana, kwa hivyo wakati ukuzaji wa PCR, bidhaa za PCR zilizokuzwa ni mfuatano usio na kusudi.Mfuatano unaolengwa ni mfupi sana au kitangulizi ni kifupi sana, na huathiriwa na chanya zisizo za kweli.Inahitaji kuundwa upya.

Uchafuzi wa msururu wa mfuatano lengwa au bidhaa za ukuzaji: Kuna sababu mbili za uchafuzi huu: Kwanza, uchafuzi wa mtambuka wa genomu nzima au sehemu kubwa, na kusababisha chanya za uwongo.Aina hii ya chanya ya uwongo inaweza kutatuliwa kwa njia zifuatazo: Kuwa mwangalifu na mpole wakati wa operesheni ili kuzuia mlolongo unaolengwa usivutwe ndani ya sampuli ya bunduki au kurusha nje ya bomba la katikati.Isipokuwa kwa enzymes na vitu ambavyo haviwezi kuhimili joto la juu, vitendanishi vyote au vifaa vinapaswa kuwa disinfected na shinikizo la juu.Mabomba ya centrifugal na sampuli zinapaswa kutumika kwa wakati mmoja.Inapohitajika, kabla ya kuongeza vielelezo, bomba la majibu na reagent zinakabiliwa na mionzi ya ultraviolet ili kuharibu asidi ya nucleic iliyopo.Pili, vipande vidogo katika uchafuzi wa hewa.Vipande hivi vidogo ni vifupi kuliko mlolongo unaolengwa, lakini wana homolojia fulani.Inaweza kuunganishwa na kila mmoja.Baada ya kukamilisha primers, bidhaa ya PCR inaweza kupanuliwa, ambayo itasababisha uzalishaji wa uongo.Inaweza kutumika kupunguza au kuondoa njia ya PCR ya kiota.

● Kuonekana mkanda wa ukuzaji usio maalum

Bendi zilizoonekana baada ya kukuza PCR haziendani na ukubwa unaotarajiwa, au kubwa au ndogo, au wakati huo huo, au wakati huo huo, bendi maalum za amplification na bendi zisizo maalum za amplification.Kutokeza kwa bendi zisizo maalum ni: Kwanza, vianzio havijakamilika vinavyosaidiana na mfuatano lengwa, au upolimishaji wa kianzio ili kuunda nguzo ya di.Ya pili ni kwamba mkusanyiko wa MG2 + ions ni kubwa sana, joto la annealing ni ndogo sana, na idadi ya mzunguko wa PCR inahusiana.Pili, ubora na kiasi cha enzymes.Mara nyingi, enzymes za vyanzo vingine zinakabiliwa na bendi zisizo maalum na enzymes za chanzo kingine hazijatokea.Wakati mwingine amplification isiyo maalum ya enzymes pia hutokea.Hatua za kukabiliana ni: vivutio vilivyoundwa upya ikiwa ni lazima.Punguza kiasi cha kimeng'enya au ubadilishe kimeng'enya cha chanzo kingine.Punguza kiasi cha msingi, ongeza idadi ya violezo ipasavyo, na punguza idadi ya mizunguko.Ongeza halijoto ya kuchubua ipasavyo au tumia mbinu mbili za uhakika wa halijoto (93°C kuzorota, kupenyeza na kupanua karibu 65°C).

● Onyesha tape nyembamba au mkanda wa kupaka

Ukuzaji wa PCR wakati mwingine huonekana kuwekwa au kuwekwa ganda au mkanda unaofanana na zulia.Kwa sababu hiyo, kutokana na kiasi kikubwa cha vimeng'enya au ubora duni wa kimeng'enya, ukolezi wa dNTP ni wa juu sana, ukolezi wa Mg2+ ni wa juu sana, halijoto ya annealing ni ya chini sana, na idadi ya mizunguko ni kubwa mno.Hatua za kukabiliana ni: ①Punguza kiasi cha vimeng'enya, au badilisha kimeng'enya cha chanzo kingine.②Punguza mkusanyiko wa dNTP ③Punguza ipasavyo mkusanyiko wa Mg2+.④Ongeza wingi wa violezo na upunguze idadi ya mizunguko.

Bidhaa Zinazohusiana

PCR Heroᵀᴹ (Yenye Rangi)

◮ Uaminifu wa juu: mara 6 ya kimeng'enya cha kawaida cha Taq;

◮ Kasi ya ukuzaji wa kasi zaidi

◮ Kubadilika zaidi kwa kiolezo

◮ Ufanisi wa juu wa ukuzaji

◮ Uvumilivu wa mazingira ni nguvu zaidi: huwekwa kwa 37 ° C kwa wiki, kudumisha shughuli zaidi ya 90%;

◮ Ina 5'→3' DNA polymerase shughuli na 5'→3' shughuli exonuclease, bila 3'→5' shughuli exonuclease.

PCR Easyᵀᴹ (Yenye Rangi)

Mfumo wa kipekee wa athari na Taq DNA Polymerase ya ubora wa juu hufanya mmenyuko wa PCR kuwa na ufanisi wa juu wa ukuzaji, umaalumu na usikivu.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Hatua Moja)-SYBR Green I

◮ Seti ya hatua moja hufanya unukuzi wa kinyume na qPCR miitikio miwili katika mrija mmoja, unahitaji tu kuongeza kiolezo cha RNA, vianzio mahususi vya PCR na ddH ya RNase-Free₂O.

◮ Seti inaweza kuchanganua kwa haraka na kwa ufanisi kiasi cha RNA ya virusi au kufuatilia RNA.

◮ Seti hii hutumia kitendanishi cha kipekee cha unukuzi cha Foregene reverse na Foregene HotStar Taq DNA Polymerase pamoja na mfumo wa kipekee wa maitikio ili kuboresha ufanisi wa ukuzaji na umahususi wa maitikio.

◮ Mfumo wa maitikio ulioboreshwa hufanya maitikio kuwa na unyeti wa juu wa ugunduzi, uthabiti mkubwa wa joto na ustahimilivu bora.

◮ RT-qPCR Rahisi^TM(Hatua Moja)-SYBR Green I kit huja na rangi ya kumbukumbu ya ndani ya ROX, ambayo inaweza kutumika kuondoa usuli wa mawimbi na hitilafu za ishara kati ya visima, ambayo ni rahisi kwa wateja kutumia katika miundo tofauti ya vyombo vya upimaji vya PCR.

RT Rahisi^TMII (Master Premix ya kwanza-strand cDNA awali kwaPCR ya Wakati Halisi)

-Uwezo mzuri wa kuondoa gDNA, ambayo inaweza kuondoa gDNA kwenye kiolezo ndani ya dakika 2.

-Mfumo mzuri wa unukuzi wa nyuma, inachukua dakika 15 tu kukamilisha usanisi wa safu ya kwanza ya cDNA.

-Violezo tata: violezo vilivyo na maudhui ya juu ya GC na muundo changamano wa pili pia vinaweza kubadilishwa kwa ufanisi wa juu.

-Mfumo wa unukuzi wa reverse wenye usikivu wa hali ya juu, violezo vya kiwango cha pg pia vinaweza kupata cDNA ya ubora wa juu.

-Mfumo wa unukuu wa kinyume una uthabiti wa hali ya juu wa joto, halijoto ya kufaa zaidi ya maitikio ni 42℃, na bado una utendaji mzuri wa unukuzi wa kinyume katika 50℃.