RT-qPCR ni jaribio la kimsingi la baiolojia ya molekuli, na kila mtu lazima aifahamu.Inajumuisha hatua tatu: uchimbaji wa RNA, unukuzi wa kinyume kuwa cDNA, na PCR ya upimaji wa umeme wa wakati halisi.Haisaidii, nini kinaendelea?Kuna uwezekano kwamba kuna shida najaribio la unukuu wa kinyume!Ingawa inaonekana kuwa jaribio la unukuzi wa kinyume linahitaji tu kuongeza RNA, dNTP, vianzio, nareverse transcriptasekwa bomba la centrifuge na kuchanganya vizuri, lakini katika mchakato halisi wa operesheni, bado kuna maelezo mengi ambayo yanahitaji kulipwa makini.Hebu tujifunze kuhusu hilo!

Jinsi ya kuhukumu ubora wa RNA?
Ili kupata cDNA, ubora wa RNA ni muhimu!Ubora wa RNA unaweza kugunduliwa haswa kutoka kwa nyanja mbili:
(1) uadilifu wa RNA:Uadilifu wa RNA unaweza kuthibitishwa na electrophoresis ya gel ya agarose. Tukichukua yukariyoti kama mfano, jumla kamili ya RNA ina bendi tatu zilizo wazi, uzito wa molekuli kutoka kubwa hadi ndogo ni 28S, 18S, na 5S, na 28S ni mara mbili ya 18S;ikiwa bendi tatu zinaweza kuonekana, lakini aina ya bendi imetiwa ukungu au Usambazaji unamaanisha kuwa RNA imeharibiwa kwa kiasi.Kwa wakati huu, tafadhali tekeleza maitikio ya unukuzi wa kinyume mara moja na uongeze kiolezo ipasavyo;ikiwa bendi iliyo na uzani mdogo wa Masi au bila bendi inaweza kuonekana, RNA imeharibiwa kabisa na inahitaji kutolewa tena.Agilent 2100 inaonyesha uadilifu wa RNA yenye mchoro wa kilele na thamani ya RIN.Ikiwa asidi ya nucleic ni intact, msingi wa electropherogram ni gorofa;ikiwa asidi ya nucleic imeharibiwa sana, msingi haufanani na vilele zaidi vya uharibifu vinaonekana;thamani ya RIN inaonyesha uadilifu wa RNA, ndani ya anuwai ya 0-10, thamani kubwa, ubora bora wa RNA.Naam, kiwango cha juu cha ukamilifu.
(2) Usafi wa RNA:Uwiano wa OD260/280 unaweza kutambuliwa na spectrophotometry ya UV.Ikiwa uwiano wa OD260/280 ni kati ya 1.9 na 2.1, usafi ni mzuri sana.
DNA iliyobaki ya genomic inaweza kusababisha matokeo ya kiasi yasiyo sahihi
RNA inapotolewa, RNA tunayopata inaweza kuchanganywa na DNA ya jeni (gDNA) ambayo haijasafishwa.Kwa hivyo, cDNA baada ya unukuzi wa kinyume pia itachanganywa nagDNA.Wakati wa mkondo wa chiniqPCRmajibu,cDNAna gDNA inaweza kukuzwa kwa wakati mmoja, na kusababisha thamani ndogo ya CT, kwa hivyo matokeo yanaweza kuwa ya upendeleo.
Kwa hivyo tunapaswa kufanya nini katika hali hii?Foregeneinapendekeza:
(1) Fanya usafishaji wa jenomu kwenye RNA iliyogeuzwa, ambayo inaweza kuondolewa kwa uchimbaji wa safu wima wakati wa uchimbaji wa RNA;
(2) Tibu RNA iliyotolewa kwa DNaseI , lakini ikomeshe kwa EDTA;
ya vitendanishi vya unukuzi kinyumena moduli za kusafisha genome;

Jinsi ya kuchagua primers kwa transcription reverse?
Vianzio vya unukuu vya kinyume pia huathiri matokeo ya athari ya unukuzi wa kinyume.Unaweza kuchagua viasili nasibu, Oligo dT au viasili maalum vya jeni kwa unukuzi wa kinyume kulingana na hali mahususi ya jaribio:
(1) Nakala maalum: primers maalum za jeni zinapendekezwa;
(2) Nakala za vipande virefu: Oligo dT/vitangulizi maalum vya jeni vinapendekezwa;
(3) Vipande vya ndani vya nakala za sehemu ndefu: vianzilishi maalum vya jeni/ vianzilishi nasibu / vianzilishi nasibu + Oligo dT.Ikiwa jaribio linalofuata la qPCR litafanywa, Oligo dT haiwezi kutumika peke yake, kwa sababu kutumia Oligo dT pekee kunaweza kusababisha upendeleo wa 3′, na kusababisha matokeo yasiyo sahihi ya majaribio ya qPCR;
(4) miRNA: Viunzi vya msingi vya kitanzi au vitanzi vya mkia vinaweza kutumika.

Je, cDNA ya bidhaa ya unukuzi ya kinyume inapaswa kuongezwa mara ngapi ili kutathminiwa?
Baada ya kupata cDNA ya bidhaa ya unukuzi kinyume, ni mara ngapi cDNA inapaswa kuongezwa kwa majaribio ya qPCR ni muhimu sana.Ikiwa ukolezi wa cDNA ni wa juu sana au chini sana, ufanisi wa ukuzaji unaweza kuathiriwa.Je, ukolezi wa cDNA unaweza kupimwa, na unapaswa kufanywaje?
(1) Mkusanyiko wa cDNA wa bidhaa ya unukuzi wa kinyume hauwezi kupimwa, kwa sababu pamoja na bidhaa ya cDNA, bidhaa ya unukuzi wa kinyume pia ina mabaki ya unukuzi wa kinyume, nakala ya reverse, vianzio, n.k., ambayo itaingilia matokeo ya kipimo cha ukolezi na kusababisha OD260/280, OD260/ 230 uwiano wa cDNA hauakisi a.Kwa wakati huu, marafiki wengine watasema, basi nitapima mkusanyiko baada ya utakaso;hapa,Forgene angependa kukumbusha kwamba cDNA haipendekezwi kusafishwa, kwa sababu urefu wa cDNA iliyopatikana kwa kugeuza ni tofauti, na cDNA fupi itapotea katika utakaso.
(2) Kwa hivyo nini cha kufanya?Kabla ya jaribio la qPCR, kipenyo cha dilution cha cDNA kinaweza kubainishwa kupitia jaribio la awali .Kwa mfano: tumia suluhisho la hisa la cDNA, dilution mara 10, na dilution mara 100 kama violezo vya majaribio ya qPCR, na uchague kipengele cha dilution chenye thamani ya CT katika safu ya 18-28.

Je, miRNA inapaswa kunukuliwaje kinyume?
miRNA ni molekuli ndogo yenye nyuzi moja ya RNA yenye ukubwa wa takriban nt 22 ambayo haina msimbo wa protini.Kwa sababu ya urefu wake mfupi, njia ya kawaida ya qPCR ni vigumu kuihesabu moja kwa moja, hivyo mara nyingi ni muhimu kupanua miRNA;mbinu zinazotumiwa kwa kawaida za unukuzi wa kinyume kwa miRNA ni pamoja na mbinu ya kitanzi-shina na mbinu ya mkia.
Njia ya kitanzi-shina ni kupanua miRNA kwa kuongeza vianzilishi vya kitanzi cha shina.Mbinu hii ya utambuzi ina unyeti na umaalum wa hali ya juu, lakini ugunduzi ni mdogo.Unukuzi mmoja wa kinyume unaweza tu kugundua miRNA moja na rejeleo la ndani;njia ya kuongeza mkia inaundwa na mbili Inakamilishwa na hatua ya pamoja ya vimeng'enya viwili, ambavyo ni PolyA polymerase na reverse transcriptase.PolyA polymerase ina jukumu la kuongeza mikia ya PolyA kwenye miRNA ili kuongeza urefu wake, na nakala ya reverse transcriptase hufanya unukuzi wa kinyume.Mbinu hii ina uwezo wa juu wa utambuzi na inaweza kutambua miRNA nyingi na marejeleo ya ndani katika unukuzi mmoja wa kinyume, lakini unyeti na umaalum ni mdogo katika mbinu ya kitanzi-shina.