PCR ndiyo teknolojia inayotumika sana ya kukuza asidi ya nukleiki na inatumika sana kutokana na unyeti na umaalum wake.Hata hivyo, PCR inahitaji kurudiwa kwa joto na haiwezi kuondokana na mapungufu ya kutegemea vyombo na vifaa, ambayo hupunguza matumizi yake katika majaribio ya uwanja wa kliniki.

Tangu miaka ya mapema ya 1990, maabara nyingi zimeanza kuendeleza teknolojia ya kukuza joto mara kwa mara ambayo hauhitaji denaturation ya joto.Sasa wameunda teknolojia ya ukuzaji wa isothermal inayoingiliana na kitanzi, teknolojia ya ukuzaji wa isothermal ya uingizwaji wa nyuzi, teknolojia ya kukuza mduara wa isothermal, na utegemezi wa mfuatano wa asidi ya nuklei.Teknolojia ya ukuzaji wa isothermal na teknolojia zingine. 

Lukuzaji wa isothermal unaoingiliana na oop

Kanuni ya ukuzaji inategemea ukweli kwamba DNA iko katika hali ya msawazo inayobadilika karibu 65°C.Wakati kianzilishi chochote kinapooanishwa msingi na kupanuliwa hadi sehemu inayosaidia ya DNA yenye nyuzi mbili, uzi mwingine utajitenga na kuwa wa nyuzi moja.

Katika halijoto hii, DNA hutumia vianzio 4 maalum kutegemea polimerasi ya DNA ya kuhamishwa kwa kamba kufanya usanisi wa DNA ya uhamishaji wa kamba ijizunguke yenyewe mfululizo.

Kwanza tambua maeneo 6 mahususi F3, F2, F1, B1, B2, B3 kwenye jeni lengwa, na kisha utengeneze vianzio 4 kulingana na maeneo haya 6 maalum (kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro ulio hapa chini):

Kitangulizi cha ndani cha mbele (FIP) kinaundwa na F1c na F2.

Kitangulizi cha nyuma cha ndani (BIP) kinaundwa na B1c na B2, na TTTT inatumika kama kianga katikati.

Vianzilishi vya nje F3 na B3 vinaundwa kwa mtiririko wa F3 na B3 kwenye jeni inayolengwa.

Katika mfumo wa mmenyuko wa LAMP, mkusanyiko wa primer ya ndani ni mara kadhaa ya primer ya nje.Utangulizi wa ndani kwanza huunganishwa na uzi wa kiolezo ili kuunganisha uzi unaosaidia kuunda uzi mbili wa DNA.Baadaye, primer ya nje inaunganishwa na template strand kuunda DNA mbili strand.Chini ya hatua ya BstDNA polymerase, kamba ya ziada iliyounganishwa na primer ya ndani inatolewa.Baada ya mfululizo wa athari, uzi unaosaidia hatimaye huunda uzi mmoja wa DNA na muundo wa dumbbell.

Muundo wa dumbbell DNA uzi moja yenyewe hutumiwa kama kiolezo ili kuendelea kuunda muundo wa mpito wa kitanzi cha DNA na ncha iliyo wazi.Vianzio vya ndani na nje huongoza DNA ya muundo wa mpito wa kitanzi cha shina kuendelea kupitia uhamishaji wa kamba na miitikio ya upanuzi, na hatimaye kuunda miundo mingi ya kitanzi cha shina yenye urefu tofauti.Mchanganyiko wa DNA.

Manufaa na hasara za ukuzaji wa isothermal wa kitanzi-mediated

Faida za LAMP:

(1) Ufanisi wa juu wa ukuzaji, ambao unaweza kukuza kwa ufanisi nakala 1-10 za jeni lengwa ndani ya 1h, na ufanisi wa ukuzaji ni mara 10-100 kuliko PCR ya kawaida.

(2) Muda wa majibu ni mfupi, maalum ni kali, na hakuna vifaa maalum vinavyohitajika.

Mapungufu ya LAMP:

(1) Mahitaji ya vianzio ni vya juu sana.

(2) Bidhaa iliyoimarishwa haiwezi kutumika kwa uundaji wa cloning na mpangilio, lakini inaweza tu kutumika kwa uamuzi.

(3) Kutokana na unyeti wake mkubwa, ni rahisi kuunda erosoli, na kusababisha chanya cha uongo na kuathiri matokeo ya mtihani.

Sukuzaji wa uhamishaji wa trand

Ukuzaji wa uhamishaji wa Strand (SDA) ni mbinu ya ukuzaji wa DNA isothermal ya in vitro kulingana na mmenyuko wa enzymatic uliopendekezwa kwanza na msomi wa Amerika Walker mnamo 1992.

Mfumo wa kimsingi wa SDA ni pamoja na kizuizi cha endonuclease, polimerasi ya DNA yenye shughuli ya kuhamisha kamba, jozi mbili za vianzio, dNTPs, na ioni za kalsiamu na magnesiamu na mifumo ya bafa.

Kanuni ya ukuzaji wa uhamishaji wa kamba inategemea mfuatano wa utambuzi wa kizuizi cha endonuclease kilichorekebishwa kwa kemikali katika ncha zote mbili za DNA inayolengwa.Endonuclease inafungua pengo katika DNA ya strand kwenye tovuti yake ya utambuzi, na polymerase ya DNA huongeza pengo 3′ Mwisho na kuchukua nafasi ya strand inayofuata ya DNA.

Nyuzi moja zilizobadilishwa za DNA zinaweza kuunganishwa na vianzio na kupanuliwa kuwa nyuzi mbili na DNA polymerase.Utaratibu huu unarudiwa mara kwa mara, ili mlolongo wa lengo uimarishwe kwa ufanisi.

Faida na hasara za teknolojia ya kukuza uhamishaji wa strand

Manufaa ya SDA:

Ufanisi wa amplification ni wa juu, muda wa majibu ni mfupi, maalum ni nguvu, na hakuna vifaa maalum vinavyohitajika.

Mapungufu ya SDA:

Bidhaa hizo si sare, na baadhi ya bidhaa za kamba moja na mbili hutolewa kila wakati katika mzunguko wa SDA, na mkia utatokea bila kuepukika wakati unapogunduliwa na electrophoresis.

Rukuzaji wa mduara wa olling

Ukuzaji wa mduara wa rolling (RCA) unapendekezwa kwa kuchora kwenye njia ya kunakili DNA kutoka kwa viumbe vya pathogenic kwa kuviringisha duara.Inarejelea matumizi ya DNA ya mduara yenye ncha moja kama kiolezo katika halijoto isiyobadilika, na polimasi maalum ya DNA (kama vile Phi29) ) Chini ya hatua ya usanisi wa DNA ya mduara ili kufikia ukuzaji wa jeni lengwa.

RCA inaweza kugawanywa katika ukuzaji wa mstari na ukuzaji wa kielelezo.Ufanisi wa mstari wa RCA unaweza kufikia 10⁵nyakati, na ufanisi wa RCA ya kielelezo inaweza kufikia 10⁹nyakati.

Tofauti rahisi, kama inavyoonyeshwa kwenye mchoro hapa chini, ukuzaji wa mstari a hutumia kitangulizi 1 pekee, ukuzaji wa kielelezo b una vianzio 2.

Linear RCA pia inaitwa single primer RCA.Primer hufunga kwa DNA ya mviringo na hupanuliwa na hatua ya DNA polymerase.Bidhaa ni mstari wa uzi mmoja na idadi kubwa ya mfuatano unaojirudia mara maelfu ya urefu wa kitanzi kimoja.

Kwa kuwa bidhaa ya RCA ya mstari daima inaunganishwa na primer ya kuanzia, fixation rahisi ya ishara ni faida kubwa.

RCA kielelezo, pia inajulikana kama Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), katika RCA exponential, primer moja hukuza bidhaa RCA, primer pili mseto na RCA bidhaa na kupanuka, na uingizwaji tayari inahusishwa na bidhaa RCA The primers mkondo kupanua strand, na kurudia ugani na uingizwaji wa RCA amplification bidhaa.

faida na hasara ya rolling mduara nucleic acid amplification

Manufaa ya RCA:

Usikivu wa juu, maalum nzuri na uendeshaji rahisi.

Mapungufu ya RCA:

Matatizo ya usuli wakati wa kutambua mawimbi.Wakati wa majibu ya RCA, uchunguzi wa kufuli ambao haujasambazwa na DNA ya kiolezo au RNA ya uchunguzi usiofungamana unaweza kutoa ishara fulani za usuli. 

Nukuzaji wa msingi wa mfuatano wa ucleicacid

Ukuzaji kwa msingi wa mfuatano wa asidi ya nyuklia (NASBA) ni teknolojia mpya iliyotengenezwa kwa msingi wa PCR.Ni upanuzi wa asidi ya nukleiki unaoendelea na wa isothermal unaoongozwa na jozi ya primers na mlolongo wa waendelezaji wa T7.Teknolojia hiyo inaweza kukuza kiolezo cha RNA kwa takriban mara 109 ndani ya saa 2 hivi, ambayo ni mara 1000 zaidi ya njia ya kawaida ya PCR na haihitaji vifaa maalum.

Teknolojia hii imetumika kwa utambuzi wa haraka wa magonjwa mara tu ilipoonekana, na kampuni nyingi kwa sasa hutumia njia hii katika vifaa vya kugundua RNA.

Ingawa ukuzaji wa RNA pia unaweza kutumia teknolojia ya PCR ya unukuzi wa kinyume, NASBA ina faida zake yenyewe: inaweza kufanywa chini ya hali ya joto isiyobadilika, na ni thabiti na sahihi zaidi kuliko teknolojia ya jadi ya PCR.

Athari iko katika nyuzi joto 41 na inahitaji AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase na jozi ya vianzio ili kukamilisha.

Mchakato hasa ni pamoja na:

Kitangulizi cha mbele kina mfuatano wa ziada wa kikuzaji T7.Wakati wa mmenyuko, primer ya mbele hufunga kwenye strand ya RNA na inachochewa na kimeng'enya cha AMV ili kuunda DNA-RNA mbili strand.

RNase H humeng'enya RNA katika safu-mbili mseto na kubakisha DNA yenye ncha moja.

Chini ya hatua ya primer reverse na enzyme AMV, DNA mbili strand yenye mlolongo wa kukuza T7 huundwa.

Chini ya hatua ya T7 RNA polymerase, mchakato wa unukuzi umekamilika na kiasi kikubwa cha lengo la RNA hutolewa.

Manufaa ya NASBA:

(1) Kitangulizi chake kina mfuatano wa kikuzaji cha T7, lakini DNA yenye ncha mbili ya kigeni haina mfuatano wa kikuzaji cha T7 na haiwezi kukuzwa, kwa hivyo teknolojia hii ina umaalum wa hali ya juu na usikivu.

(2) NASBA hujumuisha moja kwa moja mchakato wa unukuzi wa kinyume katika majibu ya ukuzaji, kufupisha muda wa majibu.

Hasara za NASBA:

(1) Vipengele vya majibu ni ngumu zaidi.

(2) Aina tatu za vimeng'enya zinahitajika ili kufanya mmenyuko kuwa na gharama kubwa zaidi.