Thamani ya Ct ndiyo aina muhimu zaidi ya uwasilishaji wa matokeo ya PCR ya kiasi cha umeme.Inatumika kukokotoa tofauti za usemi wa jeni au nambari ya nakala ya jeni.Kwa hivyo ni nini thamani ya Ct ya ukadiriaji wa fluorescence inachukuliwa kuwa sawa?Jinsi ya kuhakikisha safu bora ya thamani ya Ct?
Thamani ya Ct ni nini?
Wakati wa mchakato wa ukuzaji wa qPCR, idadi inayolingana ya mizunguko ya ukuzaji (Kizingiti cha Mzunguko) wakati ishara ya umeme ya bidhaa iliyoimarishwa inafikia kizingiti cha umeme kilichowekwa.C inawakilisha Mzunguko na T inawakilisha Kizingiti.Kwa ufupi, thamani ya Ct ni idadi ya mizunguko inayolingana na wakati ukuzaji wa kiolezo cha awali hufikia kiasi fulani cha bidhaa katika qPCR.Kinachojulikana kama "kiasi fulani cha bidhaa" kitaelezewa zaidi baadaye.
Je, thamani ya Ct hufanya nini?
1.Uhusiano kati ya ukuzaji wa kielelezo, kiasi cha kiolezo na thamani ya Ct
Kwa hakika, jeni katika qPCR hukusanywa kwa ukuzaji wa kielelezo baada ya idadi fulani ya mizunguko.Uhusiano kati ya idadi ya mizunguko ya ukuzaji na kiasi cha bidhaa ni: Kiasi cha bidhaa iliyoimarishwa = kiasi cha kiolezo cha awali × (1+En) nambari ya mizunguko.Walakini, majibu ya qPCR sio kila wakati katika hali bora.Wakati kiasi cha bidhaa iliyoimarishwa kinafikia "kiasi fulani cha bidhaa", idadi ya mizunguko kwa wakati huu ni thamani ya Ct, na iko katika kipindi cha ukuzaji wa kielelezo.Uhusiano kati ya thamani ya Ct na kiasi cha kiolezo cha kuanzia: Kuna uhusiano wa mstari kati ya thamani ya Ct ya kiolezo na logariti ya nambari ya nakala ya kuanzia ya kiolezo.Kadiri mkusanyiko wa kiolezo cha awali unavyoongezeka, ndivyo thamani ya Ct inavyopungua;kadiri mkusanyiko wa kiolezo cha awali unavyopungua, ndivyo thamani ya Ct inavyokuwa kubwa.
2.Curve ya ukuzaji, kizingiti cha umeme na kiasi fulani cha bidhaa za PCR
Kiasi cha bidhaa ya ukuzaji wa qPCR huwasilishwa moja kwa moja katika mfumo wa mawimbi ya umeme, ambayo ni, curve ya ukuzaji.Katika hatua ya awali ya PCR, amplification iko chini ya hali nzuri, idadi ya mizunguko ni ndogo, mkusanyiko wa bidhaa ni ndogo, na kiwango cha fluorescence haiwezi kutofautishwa wazi na historia ya fluorescence.Baada ya hayo, fluorescence huongezeka na huingia katika awamu ya kielelezo.Kiasi cha bidhaa ya PCR kinaweza kutambuliwa wakati fulani wakati mmenyuko wa PCR uko katika awamu ya kielelezo, ambayo inaweza kutumika kama "kiasi fulani cha bidhaa", na maudhui ya awali ya kiolezo yanaweza kutambuliwa kutoka kwa hili.Kwa hiyo, kiwango cha ishara ya fluorescence sambamba na kiasi fulani cha bidhaa ni kizingiti cha fluorescence.
Katika hatua ya mwisho ya PCR, curve ya ukuzaji haionyeshi tena ukuzaji wa kielelezo, na huingia kwenye awamu ya mstari na awamu ya uwanda.
3.Uzalishaji tena wa maadili ya Ct
Wakati mzunguko wa PCR unafikia nambari ya mzunguko wa thamani ya Ct, imeingia sasa hivi katika kipindi cha ukuzaji wa kielelezo cha kweli.Kwa wakati huu, hitilafu ndogo haijaimarishwa, hivyo reproducibility ya thamani ya Ct ni bora, yaani, template hiyo inakuzwa kwa nyakati tofauti au katika zilizopo tofauti kwa wakati mmoja.Amplification, thamani ya Ct iliyopatikana ni mara kwa mara.
1.Ufanisi wa ukuzaji En
Ufanisi wa ukuzaji wa PCR unarejelea ufanisi ambao polimerasi hubadilisha jeni ili kukuzwa kuwa amplicon.Ufanisi wa ukuzaji wakati molekuli moja ya DNA inabadilishwa kuwa molekuli mbili za DNA ni 100%.Ufanisi wa ukuzaji huonyeshwa kwa kawaida kama En.Ili kuwezesha uchanganuzi wa vifungu vifuatavyo, mambo yanayoathiri ufanisi wa ukuzaji huletwa kwa ufupi.
| Mambo yanayoathiri | maelezo | Jinsi ya kuhukumu? |
| Vizuizi vya A. PCR | 1. Kiolezo cha DNA kina vitu vinavyozuia athari ya PCR, kama vile protini au sabuni.2. cDNA baada ya unukuzi wa kinyume ina mkusanyiko wa juu wa vijenzi vya kiolezo vya RNA au RT, ambavyo vinaweza pia kuzuia athari inayofuata ya PCR. | 1. Ikiwa kuna uchafuzi wa mazingira inaweza kuhukumiwa kwa kupima uwiano wa A260/A280 na A260/A230 au RNA electrophoresis.2. Iwapo cDNA imepunguzwa kulingana na uwiano fulani baada ya unukuzi wa kinyume. |
| B. Muundo usiofaa wa primer | Primers hazipunguzi kwa ufanisi | Angalia vianzio kwa vipima vya kwanza au pini za nywele, zisizolingana, na wakati mwingine miundo ya utangulizi. |
| C. Usanifu usiofaa wa programu ya majibu ya PCR | 1. Primers haziwezi kumaliza kwa ufanisi2. Utoaji wa kutosha wa DNA polymerase 3. Shughuli ya muda mrefu ya joto la juu ya DNA polymerase ilipungua | 1. Joto la annealing ni kubwa zaidi kuliko thamani ya TM ya primer2. Muda wa kabla ya kuashiria ni mfupi sana 3. Muda wa kila hatua ya utaratibu wa majibu ni mrefu sana |
| D. Uchanganyiko wa kutosha wa vitendanishi au makosa ya bomba | Katika mfumo wa majibu, mkusanyiko wa ndani wa vijenzi vya athari ya PCR ni wa juu sana au haufanani, na hivyo kusababisha ukuzaji usio wa kielelezo wa ukuzaji wa PCR. | |
| E. Urefu wa Amplicon | Urefu wa amplicon ni mrefu sana, unazidi 300bp, na ufanisi wa ukuzaji ni mdogo. | Angalia kuwa urefu wa amplicon ni kati ya 80-300bp |
| F. Ushawishi wa vitendanishi vya qPCR | Mkusanyiko wa polimerasi ya DNA katika kitendanishi ni mdogo au ukolezi wa ayoni kwenye bafa haujaboreshwa, na kusababisha shughuli ya kimeng'enya cha Taq kutofikia kiwango cha juu zaidi. | Uamuzi wa ufanisi wa ukuzaji kwa curve ya kawaida |
2. Aina mbalimbali za maadili ya Ct
Thamani za Ct zinaanzia 15-35.Ikiwa thamani ya Ct ni chini ya 15, inachukuliwa kuwa amplification iko ndani ya kipindi cha msingi na kizingiti cha fluorescence haijafikiwa.Kwa hakika, kuna uhusiano wa kimstari kati ya thamani ya Ct na logariti ya nambari ya nakala ya awali ya kiolezo, yaani, mkunjo wa kawaida.Kupitia curve ya kawaida, wakati ufanisi wa amplification ni 100%, thamani ya Ct iliyohesabiwa kwa kuhesabu nambari ya nakala moja ya jeni ni karibu 35. Ikiwa ni kubwa kuliko 35, nambari ya nakala ya awali ya template ni kinadharia chini ya 1, ambayo inaweza kuchukuliwa kuwa haina maana.
Kwa safu tofauti za jeni za Ct, kwa sababu ya tofauti katika nambari ya nakala ya jeni na ufanisi wa ukuzaji katika kiasi cha kiolezo cha awali, ni muhimu kutengeneza mkunjo wa kawaida wa jeni na kukokotoa safu ya utambuzi wa mstari wa jeni.
3.Vipengele vya ushawishi vya thamani ya Ct
Kutoka kwa uhusiano kati ya idadi ya mizunguko ya kukuza na kiasi cha bidhaa: kiasi cha bidhaa iliyoimarishwa = kiasi cha nambari ya mzunguko wa template ya awali × (1+En), inaweza kuonekana kuwa chini ya hali nzuri, kiasi cha template ya awali na En itakuwa na athari mbaya kwa thamani ya Ct inathirika.Tofauti ya ubora wa kiolezo au ufanisi wa ukuzaji itasababisha thamani ya Ct kuwa kubwa sana au ndogo sana.
Thamani ya 4.Ct ni kubwa sana au ndogo sana
Muda wa kutuma: Feb-22-2023
