Kuongoza

RNA ndefu isiyo na misimbo, lncRNA ni RNA isiyo na misimbo yenye urefu wa zaidi ya nyukleotidi 200, kwa ujumla kati ya 200-100000 nt.lncRNA hudhibiti usemi wa jeni katika viwango vya epijenetiki, unukuzi na baada ya unukuzi, na hushiriki katika kunyamazisha kromosomu X, uchapishaji wa jenomu na urekebishaji wa kromatini, uanzishaji wa unukuzi, kuingiliwa kwa unukuzi, usafiri wa nyuklia, udhibiti wa mzunguko wa seli, udhibiti wa utofautishaji wa seli, na urekebishaji wa fidia nyingi ni michakato inayohusiana na uundaji wa kipimo na athari zingine muhimu za fidia. kuzuia magonjwa ya binadamu, na kwa sasa ni moja ya maeneo ya moto katika uwanja wa biomedicine.

01  Aina na sifa za LncRNA

lncRNA imegawanywa katika aina nyingi kulingana na vyanzo tofauti vya malezi yake, kama inavyoonyeshwa kwenye takwimu hapo juu.Ina sifa zifuatazo:

1. lncRNA kwa kawaida huwa ndefu, na usemi wenye nguvu na mbinu tofauti za kuunganisha wakati wa kutofautisha.
2. Ikilinganishwa na jeni za usimbaji, lncRNA kwa kawaida huwa na kiwango cha chini cha kujieleza
3. LncRNA nyingi zina umaalumu dhahiri wa usemi wa muda na anga katika mchakato wa utofautishaji na ukuzaji wa tishu.
4. Kuna maneno ya tabia katika tumors na magonjwa mengine
5. Maeneo madogo ya lncRNA ni tofauti
6. Mlolongo ni mdogo katika uhifadhi, lakini kazi ina kiwango fulani cha uhifadhi, nk.

02 Maswali Yanayoulizwa Mara Kwa Mara kuhusu Unukuzi wa Urejeshaji wa LncRNA

Kutokana na maudhui ya chini ya lncRNA katika seli, urefu mrefu na muundo wa kiwango cha juu, RNA kama hiyo mara nyingi huwa na miundo changamano kama vile vitanzi vya shina au pini za nywele, na RT-qPCR hukabiliwa na matatizo ya unukuzi wa kinyume usiofanikiwa au ufanisi mdogo.

03 Suluhisho la unukuzi la kubadilisha LncRNA

Katika kanuni kuu, mchakato wa virusi vya RNA kutumia nakala zao wenyewe za reverse ili kuunganisha DNA kwa kutumia RNA kama kiolezo huitwa unukuzi wa kinyume.Mchakato wa kutumia RNA virus reverse transcriptase ili kuunganisha kiolezo cha cDNA in vitro inaitwa reverse transcription.Vipengele kuu vilivyojumuishwa katika mfumo wa unukuzi wa kinyume: template ya RNA, transcriptase ya reverse, primers na vipengele vingine.

Kiolezo cha 1.RNA

Ushawishi wa kiolezo cha RNA kwenye unukuzi wa kinyume unaonyeshwa katika muundo wake, usafi na uadilifu.Kadiri usafi na uadilifu wa RNA iliyotolewa unavyoongezeka, ndivyo ufanisi wa unukuzi wa kinyume unavyoongezeka na matokeo ya kiasi yanayofuata yanakuwa sahihi zaidi.RNA iliyosafishwa na vitendanishi vya uchimbaji vya RNA vinavyotumika mara nyingi huwa na mabaki ya pombe na chumvi za guanidine, ambazo zina athari kubwa ya kuzuia kwa nakala nyingi za reverse.

2.Reverse transcriptase

Reverse transcriptase ina ushawishi mkuu katika mfumo mzima wa unukuzi wa kinyume.Joto linalofaa kwa nakala ya kinyume inayotumiwa katika maabara nyingi kwa ujumla ni 42°C.Kwa kweli, ufunguzi wa muundo wa kiwango cha juu cha RNA unahitaji joto la juu, na mahitaji ya reverse transcriptase ni ya juu.

3.Primer

Vitambulisho vya unukuu vya kinyume vinajumuisha vianzio vya jeni mahususi, viasili nasibu na vianzio vya Oligo dT.LncRNA nyingi hazina mikia ya polyA, na ni muhimu kulinganisha vitangulizi vya nasibu na Oligo dT.

4.Vipengele vingine

Kwa kuzingatia ukweli kwamba RNA ni rahisi sana kuharibu, uanzishaji wa vipengele katika mfumo wa unukuzi wa kinyume unaweza kupunguzwa, ambao unaweza kuzuia kwa ufanisi kuingia kwa RNase na kuhakikisha maendeleo mazuri ya unukuzi wa kinyume.

Foregenehupata kutoka kwa kiolezo cha RNA, geuza unukuzi hadi qPCR

Sambaza ugunduzi wako wa lncRNA kwa ukamilifu

Jumla ya Wanyama RNA IutulivuSeti (iliyo na safu wima ya kuondolewa kwa gDNA)

Jumla ya Seli RNA IutulivuSeti (iliyo na safu wima ya kuondolewa kwa gDNA)

Lnc-RT HeroTM I(Pamoja na gDNase)(Super Premix kwa usanisi wa cDNA ya mkondo wa kwanza kutoka lncRNA)

Wakati Halisi PCR EasyTM-SYBR Green I

Afaida ofUchimbaji wa RNA:

Seti hutumia teknolojia ya uchimbaji wa RNA ya kizazi cha tatu, hakuna haja ya kutumia DNase.

Dakika 11 kutoka 96, 24, 12, na seli 6 za sahani zilizopandwa vizuri, uchimbaji wa ufanisi wa juu wa gDNA-bure, usafi wa juu, ubora wa jumla wa seli ya RNA.

Manufaa ya unukuzi wa reverse wa lncRNA:

Mfumo wa unukuzi wa kinyume uliotengenezwa maalum kwa ajili ya LncRNA ili kuondoa haraka uchafuzi wa DNA ya jeni.

Mfumo wa unukuu wa kinyume una uthabiti wa hali ya juu wa joto na bado una utendaji mzuri wa unukuzi wa kinyume katika 50°C.

Violezo vilivyo na maudhui ya juu ya GC na muundo changamano wa pili vinaweza kubadilishwa kwa ufanisi wa juu.

Faidaof qPCR:

Hot start Foregene Taq Polymerase ina ufanisi wa juu wa ukuzaji, usikivu wa juu wa ukuzaji, na umaalum wa juu wa ukuzaji.

Mchanganyiko Rahisi wa PCR ulioboreshwa huifanya SYBR Green I kuwa na unyeti wa juu zaidi wa ugunduzi, na nguvu yake ya umeme ni mara 3-5 ya bidhaa zinazofanana, ambazo zinaweza kukidhi mahitaji ya aina tofauti za majaribio ya kiasi cha fluorescence.