Teknolojia ya utambuzi wa molekuli hutumia mbinu za baiolojia ya molekuli kugundua usemi na muundo wa nyenzo za kijeni za mwili wa binadamu na vimelea mbalimbali vya magonjwa, ili kufikia lengo la kutabiri na kutambua magonjwa.

Katika miaka ya hivi karibuni, pamoja na uboreshaji na urekebishaji wa teknolojia ya uchunguzi wa molekuli, matumizi ya kliniki ya uchunguzi wa molekuli imekuwa zaidi na ya kina zaidi na ya kina, na soko la uchunguzi wa molekuli limeingia katika kipindi cha maendeleo ya haraka.

Mwandishi anatoa muhtasari wa teknolojia za kawaida za uchunguzi wa molekuli kwenye soko, na imegawanywa katika sehemu tatu: sehemu ya kwanza inaleta teknolojia ya PCR, sehemu ya pili inaleta teknolojia ya kukuza isothermal ya asidi ya nucleic, na sehemu ya pili inaleta teknolojia ya mpangilio.

01

Sehemu ya I: Teknolojia ya PCR

Teknolojia ya PCR

PCR (polymerase chain reaction) ni moja wapo ya teknolojia ya ukuzaji wa DNA in vitro, yenye historia ya zaidi ya miaka 30.

Teknolojia ya PCR ilianzishwa mwaka wa 1983 na Kary Mullis wa Cetus, Marekani.Mullis aliomba hataza ya PCR mwaka wa 1985 na kuchapisha karatasi ya kwanza ya kitaaluma ya PCR kuhusu Sayansi katika mwaka huo huo.Mullis alishinda Tuzo ya Nobel ya Kemia mwaka wa 1993.

Kanuni za Msingi za PCR

PCR inaweza kukuza vipande lengwa vya DNA kwa zaidi ya mara milioni moja.Kanuni ni kwamba chini ya uchochezi wa polimerasi ya DNA, DNA ya uzi wa mzazi hutumiwa kama kiolezo, na kianzio maalum hutumiwa kama mahali pa kuanzia kwa upanuzi.Inaigwa kwa njia ya vitro kupitia hatua kama vile urekebishaji, ufupishaji, na upanuzi.Mchakato wa DNA ya uzi wa binti inayosaidiana na DNA ya kiolezo cha uzi wa mzazi.

Mchakato wa kawaida wa PCR umegawanywa katika hatua tatu:

1. Denaturation: Tumia halijoto ya juu kutenganisha nyuzi mbili za DNA.Vifungo vya hidrojeni kati ya nyuzi mbili za DNA huvunjwa kwa joto la juu (93-98 ° C).

2. Ufungaji: Baada ya DNA yenye ncha mbili kutenganishwa, halijoto hupunguzwa ili primer iweze kushikamana na DNA yenye nyuzi moja.

3. Upanuzi: Polimerasi ya DNA huanza kuunganisha nyuzi zinazosaidiana kwenye nyuzi za DNA kutoka kwa vianzio vinavyofungwa wakati halijoto inapungua.Wakati ugani umekamilika, mzunguko umekamilika, na idadi ya vipande vya DNA huongezeka mara mbili.

Kurudia hatua hizi tatu mara 25-35, idadi ya vipande vya DNA itaongezeka kwa kasi.

Ustadi wa PCR ni kwamba vianzilishi tofauti vinaweza kuundwa kwa jeni tofauti lengwa, ili vipande vya jeni vinavyolengwa viweze kukuzwa kwa muda mfupi.

Hadi sasa, PCR inaweza kugawanywa katika makundi matatu, yaani PCR ya kawaida, PCR ya kiasi cha fluorescent na PCR ya digital.

Kizazi cha kwanza cha PCR ya kawaida

Tumia kifaa cha kawaida cha ukuzaji cha PCR ili kukuza jeni inayolengwa, na kisha utumie elektrophoresis ya gel ya agarose kugundua bidhaa, uchambuzi wa ubora pekee unaweza kufanywa.

Hasara kuu za PCR ya kizazi cha kwanza:

-Inakabiliwa na ukuzaji usio maalum na matokeo chanya ya uwongo.

-Ugunduzi huchukua muda mrefu na operesheni ni ngumu.

-Upimaji wa ubora pekee unaweza kufanywa.

PCR ya kizazi cha pili cha fluorescence

Kipimo cha Fluorescence PCR (PCR ya Wakati Halisi), pia inajulikana kama qPCR, hutumika kufuatilia mkusanyo wa bidhaa zilizoimarishwa kupitia mkusanyiko wa mawimbi ya umeme kwa kuongeza vichunguzi vya umeme vinavyoweza kuonyesha maendeleo ya mfumo wa mmenyuko, na kutathmini matokeo kupitia kipindo cha umeme na kusaidia kupindika kwa kiwango cha quarescent.

Kwa sababu teknolojia ya qPCR inafanywa katika mfumo funge, uwezekano wa uchafuzi hupunguzwa, na mawimbi ya umeme yanaweza kufuatiliwa ili kugunduliwa kwa kiasi, kwa hivyo ndiyo inayotumika sana katika mazoezi ya kliniki na imekuwa teknolojia inayotawala katika PCR.

Dutu za umeme zinazotumiwa katika kiasi halisi cha umeme cha PCR zinaweza kugawanywa katika: Vichunguzi vya umeme vya TaqMan, vinara vya molekuli na rangi za fluorescent.

1) Uchunguzi wa umeme wa TaqMan:

Wakati wa kukuza PCR, uchunguzi maalum wa fluorescent huongezwa wakati wa kuongeza jozi ya primers.Uchunguzi ni oligonucleotide, na ncha mbili kwa mtiririko huo zimeandikwa na kikundi cha fluorescent cha mwandishi na kikundi cha fluorescent ya quencher.

Wakati uchunguzi umekamilika, ishara ya umeme iliyotolewa na kikundi cha waandishi wa habari inachukuliwa na kikundi cha kuzima;wakati wa ukuzaji wa PCR, shughuli ya exonuclease ya 5'-3′ ya kimeng'enya cha Taq hupasuka na kuharibu uchunguzi, na kufanya mwandishi wa kikundi cha fluorescent na kuzima Kikundi cha fluorescent kinatenganishwa, ili mfumo wa ufuatiliaji wa umeme uweze kupokea ishara ya fluorescence, yaani, kila wakati kamba ya DNA inapoundwa, kuongezeka kwa fluorescent, na kuongezeka kwa fluorescence. ishara imelandanishwa kabisa na uundaji wa bidhaa ya PCR.

2) rangi za umeme za SYBR:

Katika mfumo wa mmenyuko wa PCR, ziada ya rangi ya fluorescent ya SYBR huongezwa.Baada ya rangi ya fluorescent ya SYBR kuingizwa bila kuingizwa mahususi kwenye nyuzi mbili za DNA, hutoa ishara ya fluorescent.Molekuli ya rangi ya SYBR ambayo haijajumuishwa kwenye mnyororo haitatoa mawimbi yoyote ya umeme, na hivyo kuhakikisha mawimbi ya umeme Ongezeko la bidhaa za PCR linasawazishwa kabisa na ongezeko la bidhaa za PCR.SYBR hufunga kwa DNA yenye ncha mbili pekee, kwa hivyo mduara wa kuyeyuka unaweza kutumika kubainisha kama majibu ya PCR ni mahususi.

3) Beacons za Masi

Ni probe ya oligonucleotide yenye kitanzi cha shina yenye lebo mbili ambayo huunda muundo wa pini ya nywele wa besi 8 hivi kwenye ncha 5 na 3.Mifuatano ya asidi ya nuklei kwenye ncha zote mbili imeunganishwa kwa usawa, na kusababisha kikundi cha fluorescent na kikundi cha kuzimisha kuwa ngumu.Funga, haitazalisha fluorescence.

Baada ya bidhaa ya PCR kuzalishwa, wakati wa mchakato wa annealing, sehemu ya kati ya mwanga wa molekuli huunganishwa na mlolongo maalum wa DNA, na jeni la fluorescent hutenganishwa na jeni la quencher ili kuzalisha fluorescence.

Hasara kuu za PCR ya kizazi cha pili:

Unyeti bado haupo, na ugunduzi wa vielelezo vya nakala ya chini sio sahihi.

Kuna ushawishi wa thamani ya usuli, na matokeo yake yanaweza kuingiliwa.

Kizazi cha tatu cha PCR ya kidijitali

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) hukokotoa nambari ya nakala ya mfuatano lengwa kupitia ugunduzi wa sehemu ya mwisho, na inaweza kufanya utambuzi sahihi wa kiasi bila kutumia vidhibiti vya ndani na mikunjo ya kawaida.

Digital PCR hutumia utambuzi wa mwisho na haitegemei thamani ya Ct (kiwango cha juu cha mzunguko), kwa hivyo athari ya PCR ya dijiti haiathiriwi sana na ufanisi wa ukuzaji, na ustahimilivu wa vizuizi vya majibu ya PCR huboreshwa, kwa usahihi wa juu na uwezaji tena.

Kwa sababu ya sifa za unyeti wa hali ya juu na usahihi wa hali ya juu, haiingiliwi kwa urahisi na vizuizi vya mmenyuko wa PCR, na inaweza kufikia ujanibishaji kamili wa kweli bila bidhaa za kawaida, ambazo zimekuwa hotspot ya utafiti na matumizi.

Kulingana na aina tofauti za kitengo cha majibu, inaweza kugawanywa katika aina tatu: microfluidic, chip na mifumo ya droplet.