PCR ya moja kwa moja ni mmenyuko ambao hutumia tishu za wanyama au mimea moja kwa moja kwa ukuzaji bila uchimbaji wa asidi ya nucleic.Kwa njia nyingi, PCR ya moja kwa moja hufanya kazi kama PCR ya kawaida

Tofauti kuu ni bafa maalum inayotumiwa katika PCR ya moja kwa moja, sampuli inaweza kuathiriwa moja kwa moja na athari ya PCR bila uchimbaji wa asidi ya nukleiki, lakini kuna mahitaji yanayolingana ya uvumilivu wa vimeng'enya na utangamano wa bafa inayohusika katika mmenyuko wa moja kwa moja wa PCR.

Ingawa kuna vizuizi vya PCR zaidi au chache katika sampuli za kawaida, PCR ya moja kwa moja bado inaweza kufikia ukuzaji unaotegemewa chini ya hatua ya vimeng'enya na vihifadhi.Mwitikio wa kitamaduni wa PCR unahitaji asidi ya nyuklia ya ubora wa juu kama kiolezo, ambacho kinaweza kuzuia maendeleo laini ya mmenyuko wa PCR ikiwa kiolezo kina protini na uchafu mwingine.PCR ya moja kwa moja kwa sasa ni mojawapo ya teknolojia maarufu zaidi katika uwanja wa uchunguzi wa molekuli.

01 Direct PCR ilitumika awali kwa wanyama na mimea

Utumiaji wa mapema zaidi wa PCR moja kwa moja ni katika uwanja wa wanyama na mimea, kama vile damu, tishu na nywele za panya, paka, kuku, sungura, kondoo, ng'ombe, n.k., majani ya mimea na mbegu, n.k., zilizotumika kutafiti utambuzi wa jeni, ugunduzi wa plasmid, uchambuzi wa jeni, kitambulisho cha chanzo cha DNA, utambuzi wa spishi, uchambuzi wa SNP na nyanja zingine.

Maeneo haya yana sifa za kawaida, yaani, maudhui ya jeni inayolengwa ni ya juu na uchimbaji wa asidi ya nucleic ni shida, hivyo PCR ya moja kwa moja haiwezi tu kuokoa muda na kuwa na athari ndogo kwenye matokeo, lakini pia kuokoa gharama.

PCR ya moja kwa moja inayotumika kugundua pathojeni ni suala la miaka ya hivi karibuni, watengenezaji wengine wa vitendanishi vya PCR wamefanya juhudi nyingi katika mwelekeo huu wakati wa kufanya uvumbuzi.Hasa katika janga hili la COVID-19, bidhaa nyingi kama hizo za utambuzi zimeonekana kwenye soko, kama vile SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) iliyotafitiwa na kutengenezwa na Foregene, ambayo hutumia teknolojia ya wakati Halisi ya RT PCR (rRT-PCR) kwa utambuzi wa ubora wa asidi ya nuclex ya SARS-Cophary2 ya SARS-Cophary2 ya binadamu. sampuli za swab za ngeal.

Foregene ni mojawapo ya makampuni yanayotumia teknolojia ya Direct PCR, kwa ajili ya kugundua ORF1ab ya kawaida, N, E, nalahaja huweka mstari wa asidi nukleiki katika sampuli za usufi za nasopharyngeal au oropharyngeal kama vile ukoo wa SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), B.1.351 ukoo (ZA), B.1.617 ukoo (IND) na P.1 ukoo (BR).

02  Vitendanishi vinavyohitajika kwa PCR ya moja kwa moja

Mfano wa Lysate

Sampuli ya lysate inaweza kusanidiwa na wewe mwenyewe au kununuliwa.Tofauti katika muundo wa bidhaa tofauti za lysate itafanya uwezo wa uongo kuwa tofauti, na kisha wakati wa uongo utakuwa tofauti kidogo.Kwa mfano, kwa ajili ya maandalizi ya sampuli za tishu za wanyama, dakika 30 au lysis ya usiku inapendekezwa kwa ujumla, na ufumbuzi wa lysis kwa virusi huanzia dakika 3-10.

Mchanganyiko mkuu wa PCR

Inashauriwa kutumia polima ya DNA ya kuanza moto ili kuongeza ukuzaji maalum na kuongeza uwezo wa ukuzaji.Msingi wa PCR ya moja kwa moja ni polimasi inayostahimili sana.

Ondoa au uzuie vipengele katika sampuli vinavyoathiri ukuzaji wa DNA

Baada ya sampuli kusindika na lysate, protini, lipids na uchafu mwingine wa seli zitatolewa, vitu hivi vitazuia majibu ya PCR.Kwa hiyo, PCR ya moja kwa moja inahitaji kuongeza ya kuondolewa sambamba au inhibitors ili kupunguza ushawishi wa mambo haya.

03  Mkusanyiko wa pointi tano za ujuzi wa PCR moja kwa moja

Kwanza, teknolojia ya Direct PCR ni teknolojia ya PCR ya moja kwa moja kwa sampuli mbalimbali za kibiolojia.Chini ya hali hii ya kiufundi, hakuna haja ya kutenganisha na kutoa asidi ya nukleiki, kutumia sampuli ya tishu moja kwa moja kama kitu, na kuongeza viambishi vya jeni vinavyolengwa ni kutekeleza majibu ya PCR.

Pili, teknolojia ya Direct PCR sio tu teknolojia ya jadi ya ukuzaji kiolezo cha DNA, lakini pia inajumuisha nakala ya kiolezo cha RNA ya PCR.

Tatu, teknolojia ya Direct PCR haifanyi tu miitikio ya ubora wa kawaida ya PCR kwenye sampuli za tishu, lakini pia inajumuisha miitikio ya qPCR ya Wakati Halisi, ambayo inahitaji mfumo wa majibu kuwa na uwezo mkubwa wa kuingiliwa na usuli wa fluorescence na umeme asilia kuzima uwezo wa pinzani.

Nne, sampuli zinazolengwa na teknolojia ya Direct PCR zinahitaji tu kutolewa kwa violezo vya asidi ya nukleiki, na haziondoi protini, polisakharidi, ioni za chumvi, n.k. zinazoingilia athari ya PCR.Ambayo inahitaji polimasi ya asidi ya nukleiki na Mchanganyiko wa PCR katika mfumo wa mmenyuko ili kuwa na ukinzani bora na ubadilikaji ili kuhakikisha shughuli ya kimeng'enya na usahihi wa urudufishaji chini ya hali ngumu.

Tano, sampuli ya tishu inayolengwa na teknolojia ya Direct PCR bila matibabu yoyote ya urutubishaji wa asidi ya nukleiki na kiasi cha kiolezo ni kidogo sana, ambacho kinahitaji mfumo wa majibu kuwa na usikivu wa juu sana na ufanisi wa ukuzaji.