Nyenzo ya kuanzia: RNA
Unukuzi wa kiasi cha kurudi nyuma PCR (RT-qPCR) ni mbinu ya majaribio inayotumika katika majaribio ya PCR kwa kutumia RNA kama nyenzo ya kuanzia.Katika mbinu hii, jumla ya RNA au mjumbe RNA (mRNA) hunakiliwa kwanza katika DNA ya ziada (cDNA) kwa reverse transcriptase.Baadaye, majibu ya qPCR yalifanyika kwa kutumia cDNA kama kiolezo.RT-qPCR imetumika katika matumizi mbalimbali ya baiolojia ya molekuli, ikijumuisha uchanganuzi wa usemi wa jeni, uthibitishaji wa mwingiliano wa RNA, uthibitishaji wa safu ndogo ya safu, ugunduzi wa pathojeni, upimaji wa kijeni, na utafiti wa magonjwa.
Mbinu za hatua moja na mbili za RT-qPCR
RT-qPCR inaweza kukamilishwa kwa njia ya hatua moja au hatua mbili.RT-qPCR ya hatua moja inachanganya unukuzi wa kinyume na upanuzi wa PCR, kuruhusu nakala ya reverse na DNA polymerase kukamilisha majibu katika mirija sawa chini ya hali sawa za bafa.RT-qPCR ya hatua moja inahitaji tu matumizi ya viasili maalum vya mfuatano.Katika RT-qPCR ya hatua mbili, unukuzi wa kinyume na ukuzaji wa PCR hufanywa katika mirija miwili, kwa kutumia vibafa tofauti vilivyoboreshwa, hali ya athari, na mikakati ya usanifu wa kianzilishi.
| Faida | Hasara | |
| Hatua Moja | Mbinu hii ina hitilafu ndogo ya majaribio kwani miitikio yote miwili hufanywa katika mrija mmoja
Hatua chache za kupiga bomba hupunguza hatari ya uchafuzi
Inafaa kwa ukuzaji/uchunguzi wa hali ya juu, haraka na inayoweza kuzaliana tena | Miitikio ya hatua mbili haiwezi kuboreshwa tofauti
Kwa kuwa hali ya athari huingiliwa kwa kuchanganya majibu ya hatua mbili, unyeti si mzuri kama ule wa mbinu ya hatua mbili.
Idadi ya shabaha iliyogunduliwa na sampuli moja ni ndogo |
| Hatua Mbili | Uwezo wa kuunda maktaba thabiti za cDNA ambazo zinaweza kuhifadhiwa kwa muda mrefu na kutumika katika athari nyingi.
Jeni lengwa na jeni za marejeleo zinaweza kukuzwa kutoka kwa maktaba sawa ya cDNA bila hitaji la maktaba nyingi za cDNA.
Viakio vya majibu na hali za maitikio zinazowezesha uboreshaji wa utendakazi wa maitikio moja
Uchaguzi nyumbufu wa masharti ya vichochezi | Kutumia mirija mingi, na hatua zaidi za bomba huongeza hatari ya uchafuzi wa DNA, na kuteketeza muda.
Inahitaji uboreshaji zaidi kuliko mbinu ya hatua moja |
Bidhaa zinazohusiana:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Hatua Moja)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Hatua Moja)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Kwa Awali ya Awali ya CDNA
Wakati Halisi PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Uteuzi wa jumla wa RNA na mRNA
Wakati wa kubuni jaribio la RT-qPCR, ni muhimu kuamua kama utatumia jumla ya RNA au mRNA iliyosafishwa kama kiolezo cha unukuzi wa kinyume.Ingawa mRNA inaweza kutoa usikivu wa juu zaidi, jumla ya RNA bado inatumika mara kwa mara.Sababu ya hii ni kwamba jumla ya RNA ina faida muhimu zaidi kama nyenzo ya kuanzia kuliko mRNA.Kwanza, mchakato unahitaji hatua chache za utakaso, ambayo inahakikisha urejeshaji bora wa kiasi cha kiolezo na urekebishaji bora wa matokeo ili kuanza nambari za seli.Pili, inaepuka hatua ya uboreshaji wa mRNA, ambayo inaweza kuzuia uwezekano wa matokeo yaliyopotoshwa kwa sababu ya urejeshaji tofauti wa mRNA tofauti.Kwa ujumla, kwa kuwa katika matumizi mengi ukadiriaji jamaa wa jeni lengwa ni muhimu zaidi kuliko unyeti kamili wa ugunduzi, jumla ya RNA inafaa zaidi katika hali nyingi.
Reverse transcription primer
Katika mbinu ya hatua mbili, mbinu tatu tofauti zinaweza kutumika kutayarisha majibu ya cDNA: vianzio vya oligo(dT), vianzilishi nasibu, au vianzilishi mahususi kwa mfuatano.Kwa kawaida, primers za oligo (dT) na primers random hutumiwa pamoja.Vitambulisho hivi huambatanisha na uzi wa kiolezo cha mRNA na kutoa nakala ya kinyume yenye mahali pa kuanzia kwa usanisi.
| Chaguo la kwanza | Muundo na kazi | Faida | Hasara |
| Oligo(dT) primer (au oligo(dT) primer) | Kupanuliwa kwa mabaki ya thymine kwenye mkia wa poly(A) wa mRNA;kiambishi awali cha oligo(dT) kina G, C, au A kwenye mwisho wa 3′ (tovuti ya nanga) | Mchanganyiko wa cDNA ya urefu kamili kutoka kwa mRNA yenye mkia wa aina nyingi (A)
Inatumika wakati nyenzo ndogo ya kuanzia inapatikana
Tovuti ya kutia nanga huhakikisha kwamba kianzio cha oligo(dT) kinafungamana na mkia wa 5′ poly(A) wa mRNA. | Inafaa tu kwa kukuza jeni na mikia ya poly(A).
Pata cDNA iliyopunguzwa kutoka kwa tovuti ya priming*2 katika aina nyingi(A)
Inapendelea kushikamana hadi mwisho wa 3′*
*Uwezekano huu utapunguzwa ikiwa vianzio vya awali vya oligo(dT) vinatumika |
| primer random
| Besi 6 hadi 9 kwa urefu, ambazo zinaweza kushikamana na tovuti nyingi wakati wa unukuzi wa RNA | Anneal kwa RNA zote (tRNA, rRNA, na mRNA)
Inafaa kwa nakala zilizo na muundo muhimu wa pili, au wakati nyenzo ndogo ya kuanzia inapatikana
Mazao ya juu ya cDNA | cDNA imenakiliwa kinyume kutoka kwa RNA yote, ambayo kwa kawaida haitakiwi na inaweza kupunguza ishara ya mRNA lengwa.
punguza cDNA |
| vitangulizi maalum vya mlolongo | Vitambulisho maalum vinavyolenga mfuatano mahususi wa mRNA | maktaba maalum ya cDNA
Kuboresha usikivu
Kwa kutumia vianzilishi vya qPCR kinyume | Ni mdogo tu kwa usanisi wa jeni moja inayolengwa |
Reverse transcriptase
Reverse transcriptase ni kimeng'enya kinachotumia RNA kuunganisha DNA.Baadhi ya nakala za kinyume zina shughuli ya RNase na zinaweza kuharibu nyuzi za RNA katika nyuzi mseto za RNA-DNA baada ya kunakili.Ikiwa haina shughuli ya enzymatic ya RNase, RNaseH inaweza kuongezwa kwa ufanisi wa juu wa qPCR.Vimeng'enya vinavyotumika sana ni pamoja na Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase na avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Kwa RT-qPCR, ni vyema kuchagua nakala ya nyuma iliyo na uwezo wa juu wa halijoto, ili usanisi wa cDNA ufanyike kwa halijoto ya juu zaidi, kuhakikisha unakili uliofaulu wa RNA zilizo na muundo wa juu zaidi, huku zikidumisha shughuli zao kamili katika athari, na kusababisha mavuno mengi ya cDNA.
Bidhaa zinazohusiana:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Shughuli ya RNase H ya nakala ya reverse
RNaseH inaweza kuharibu nyuzi za RNA kutoka kwa nakala mbili za RNA-DNA, ikiruhusu usanisi mzuri wa DNA yenye nyuzi mbili.Hata hivyo, unapotumia mRNA ndefu kama kiolezo, RNA inaweza kuharibika kabla ya wakati, na kusababisha cDNA kupunguzwa.Kwa hivyo, mara nyingi ni manufaa kupunguza shughuli za RNaseH wakati wa uundaji wa cDNA ikiwa usanisi wa manukuu marefu yanahitajika.Kinyume chake, nakala za kinyume zenye shughuli ya RNase H mara nyingi huwa na manufaa kwa programu za qPCR kwa sababu huongeza kuyeyuka kwa nakala mbili za RNA-DNA wakati wa mzunguko wa kwanza wa PCR.
Kubuni ya primer
Vianzio vya PCR vinavyotumika kwa hatua ya qPCR katika RT-qPCR vinapaswa kuundwa kwa njia bora ili kutandaza makutano ya exon-exon, ambapo kiambishi cha ukuzaji kinaweza kupita mpaka halisi wa exon-intron.Kwa kuwa mfuatano wa DNA ya jeni iliyo na intron haujakuzwa, muundo huu unapunguza hatari ya chanya za uwongo zilizokuzwa kutokana na kuchafua DNA ya jeni.
Ikiwa vianzio haviwezi kuundwa ili kutenganisha mipaka ya exons au exon-exon, inaweza kuwa muhimu kutibu sampuli za RNA kwa DNase I isiyo na RNase au dsDNase ili kuondoa uchafuzi wa DNA ya genomic.
Udhibiti wa RT-qPCR
Udhibiti hasi wa unukuzi wa kinyume (-RT control) unapaswa kujumuishwa katika majaribio yote ya RT-qPCR ili kugundua uchafuzi wa DNA (kama vile DNA ya jeni au bidhaa za PCR kutokana na athari za awali).Kidhibiti hiki kina vijenzi vyote vya majibu isipokuwa reverse transcriptase.Kwa kuwa unukuzi wa kinyume haufanyiki na udhibiti huu, ikiwa ukuzaji wa PCR utazingatiwa, kuna uwezekano mkubwa wa uchafuzi kutoka kwa DNA.
Muda wa kutuma: Aug-02-2022
