1. Tambua kunyonya kwa ufumbuzi wa RNA
Ukosefu wa 280, 320, 230, na 260 nm inawakilisha thamani za asidi ya nukleiki, usuli (ugumu wa suluhisho), ukolezi wa chumvi, na vitu vya kikaboni kama vile protini, mtawalia.Kwa ujumla angalia tu OD260/OD280 (Uwiano, R).Wakati 1.8~2.0, tunafikiri kwamba uchafuzi wa protini au vitu vingine vya kikaboni katika RNA unaweza kuvumiliwa, lakini ikumbukwe kwamba Tris inapotumiwa kama buffer kutambua kunyonya, thamani ya R inaweza kuwa kubwa kuliko 2 (kwa ujumla inapaswa kuwa <2.2).Wakati R<1.8, uchafuzi wa protini au vitu vingine vya kikaboni katika suluhisho ni dhahiri zaidi, na hatima ya RNA inaweza kuamua kulingana na mahitaji.Wakati R>2.2, ina maana kwamba RNA imetolewa hidrolisisi katika asidi nucleic moja.
2.Mchoro wa Electrophoretic wa RNA
Kwa ujumla, gel ya denaturing hutumiwa kwa electrophoresis ya RNA, lakini ikiwa ni kwa ajili ya kuchunguza ubora wa RNA tu, gel ya denaturing sio lazima, na gel ya agarose ya kawaida inaweza kutumika.Madhumuni ya electrophoresis ni kugundua uadilifu wa bendi za 28S na 18S na uwiano wao, au uadilifu wa smear ya mRNA.Kwa ujumla, ikiwa mikanda ya 28S na 18S ni angavu, wazi, na kali (ikirejelea kingo za bendi ni wazi), na mwangaza wa 28S ni zaidi ya mara mbili wa bendi ya 18S, tunazingatia ubora wa RNA kuwa mzuri.
Zilizo hapo juu ni njia mbili tunazotumia kwa kawaida, lakini hakuna kati ya njia hizi mbili zinazoweza kutuambia wazi kama kuna RNase iliyobaki kwenye suluhu ya RNA.Ikiwa kuna kiasi kidogo sana cha RNase katika suluhisho, ni vigumu kwetu kuigundua kwa njia iliyo hapo juu, lakini athari nyingi za enzymatic zinazofuata hufanyika kwa zaidi ya digrii 37 na kwa muda mrefu.Kwa njia hii, ikiwa kuna kiasi kidogo sana cha RNase katika ufumbuzi wa RNA, basi kutakuwa na mazingira ya kufaa sana na wakati wa kucheza jukumu lao katika majaribio yafuatayo, na bila shaka majaribio yatakuwa baridi wakati huu.Hapo chini tunatanguliza njia ambayo inaweza kuthibitisha ikiwa kuna RNase iliyobaki katika suluhisho la RNA.
3. Mtihani wa kuhifadhi joto
Kulingana na mkusanyiko wa sampuli, chora RNA mbili za 1000 ng kutoka kwa suluhisho la RNA na uiongeze kwenye bomba la centrifuge la 0.5 ml, na uiongeze na pH 7.0 Tris buffer kwa jumla ya ujazo wa 10 ul, na kisha ufunge kifuniko cha bomba.Weka mmoja wao katika umwagaji wa maji kwa joto la kawaida kwa 70 ° C na uifanye joto kwa 1 h.Sehemu nyingine imehifadhiwa kwenye jokofu -20 ° C kwa saa 1.Wakati umekwisha, ondoa sampuli mbili za electrophoresis.Baada ya electrophoresis kukamilika, kulinganisha bendi za electrophoretic za mbili.Ikiwa bendi za mbili ni thabiti au hazina tofauti kubwa (bila shaka, bendi zao pia hukutana na masharti katika njia ya 2), inamaanisha kuwa hakuna uchafuzi wa RNase wa mabaki katika ufumbuzi wa RNA, na ubora wa RNA ni mzuri sana.Kinyume chake, ikiwa sampuli iliyoingizwa kwenye 70 ° C inaonyesha uharibifu wa dhahiri, inaonyesha kuwa kuna uchafuzi wa RNase katika ufumbuzi wa RNA.
2 Mbinu na mbinu za majaribio za uchimbaji wa RNA
Matatizo tunayokumbana nayo mara nyingi tunapochimba RNA ni: (1) Mavuno ya RNA ni kidogo;(2) RNA ina uchafuzi mkubwa wa chumvi;(3) RNA ina uchafuzi mkubwa wa kutengenezea kikaboni;(4) uharibifu wa sampuli na matatizo mengine
1. Kawaida kutumika jumla ya vitendanishi vya uchimbaji RNA
Mbinu ya guanidine isothiocyanate na njia ya Trizol ndizo njia zinazotumiwa sana kwa uchimbaji wa jumla ya RNA kutoka kwa tishu za wanyama na seli za wanyama.Inafaa haswa kwa sampuli ndogo na tishu ambazo ni ngumu sana kutoa, kama vile uchimbaji wa jumla wa RNA kutoka kwa ngozi ya sungura na tishu unganishi za wanyama;kwa kuongezea, Trizol, kama kitendanishi cha kusudi la jumla la lysis, inaweza pia kutumika kwa uchimbaji wa tishu za mmea, bakteria, kuvu na tishu zingine.Kwa tishu za mimea zilizo na polisakharidi na poliphenoli, kama vile camellia oleifera, majani ya chai, mbegu za rapa, n.k., mbinu ya CTAB inaweza pia kutumika kutoa jumla ya RNA.
Kama njia ya kawaida, njia ya safu-mbili pia ni maarufu sana kwa sababu ya uendeshaji wake wa joto la kawaida, hakuna haja ya kuongeza RNase, na usalama - hakuna klorofomu, phenoli na vitendanishi vingine vya kikaboni kwa uchimbaji.(bidhaa zilizopendekezwa )
2. Uchimbaji wa jumla wa RNA kutoka kwa tishu za wanyama
(1) Jaribu kuchagua tishu safi, ikiwa sio safi (ikiwezekana ndani ya miezi mitatu - 80 ℃ jokofu au waliohifadhiwa katika nitrojeni kioevu. Wakati wa kukata tishu, usikate moja kwa moja kwenye joto la kawaida, hakikisha Uiweke kwenye sanduku la barafu, jaribu kuepuka kufungia mara kwa mara na kufuta.
(2) Tumia mkasi safi na kibano kukata kipande kidogo cha tishu, jaribu kukata sehemu ya kati ya tishu wakati wa kukata sampuli, au kwanza kata kipande kikubwa cha tishu kutoka katikati, na kisha ukate sampuli kwenye mkao mpya wa chale.Kitambaa kilichoondolewa kinapaswa kuharibiwa kikamilifu, kuweka kitambaa kilichopigwa ndani ya bomba la EP bila RNase, kuongeza lysate, tishu zilizopigwa zinapaswa kuwa wazi kabisa kwa lysate, na kujiandaa kwa homogenization.
(3) Kwa tishu za kawaida, chagua tishu zenye ukubwa wa maharagwe ya mung (miligramu 30-60) kwa ajili ya kufanya homojeni.Ikiwa tishu zina kiasi kikubwa cha protini, mafuta, au tishu zenye nyuzi kama vile ini, ongeza au punguza ipasavyo kiasi cha tishu zilizokatwa (si lazima) Chagua miligramu 10~20).
(4) Ikiwa misuli ya samaki, nyama ya kamba, jellyfish na tishu zingine zilizo na maji mengi zimetolewa, kiasi cha sampuli kinapaswa kuongezwa ipasavyo (inapendekezwa miligramu 100-200).
(5) Masharti yakiruhusu, tishu za mnyama zinaweza kutolewa moja kwa moja baada ya kuunganishwa kwa homogeniza ya tishu yenye sehemu ya juu, ikiwa hakuna vifaa hivyo.
(6) RNA iliyopatikana baada ya uchimbaji wa mwisho lazima iwekwe kwenye sanduku la barafu mara moja ili kupunguza uharibifu wa RNA.
3. Uchimbaji wa RNA ya seli ya wanyama
(1) Seli za kusimamishwa: weka katikati moja kwa moja na utupe kati, osha kwa PBS tasa kwa mara 1-2, kisha sitisha kwa kiasi kinachofaa cha PBS, na kisha ongeza lysate kwa lysis.Usiongeze lysate moja kwa moja kwenye seli zilizopigwa baada ya kukataa kabisa kioevu.Hii itasababisha kifurushi cha histone kilichotolewa baada ya seli za lysed kwenye safu ya nje kuambatana na nje ya seli zilizopigwa, na hivyo kupunguza mgusano wa seli ndani ya pellet na lisate., na kusababisha uchanganuzi wa seli usio kamili na kupunguza mavuno ya RNA.
(2) Seli zinazoshikamana nusu au zisizoshikamana sana: Baada ya kutupa kati, osha na PBS kwa mara 1-2, kisha ufyonze moja kwa moja kiasi kinachofaa cha PBS na pigo sahani ya utamaduni na pipette au bunduki ili kuzima seli, na kuzipeleka kwenye seli zisizo na RNA.Ongeza lysate kwenye bomba la EP la enzyme kwa uchimbaji.
(3) Seli zinazoshikamana: zinahitaji kusagwa kwa trypsin kwanza, kisha zikusanywe kwenye mirija ya EP isiyo na RNase, kuwekwa katikati ili kuondoa ile ya juu zaidi, iliyooshwa mara 1-2 na PBS ili kuondoa trypsin iliyozidi, na kusimamishwa tena kwa kiasi kinachofaa cha PBS Kisha endelea kwa hatua ya uchimbaji.
4. Panda uchimbaji wa RNA
Tishu za mimea ni tajiri katika misombo ya phenolic, au matajiri katika polysaccharides, au zina baadhi ya metabolites za sekondari zisizojulikana, au zina shughuli nyingi za RNase.Dutu hizi zimeunganishwa kwa nguvu na RNA baada ya lysis ya seli ili kuunda complexes zisizo na maji au colloidal precipitates, ambayo ni vigumu kuondoa.Kwa hiyo, tunapochimba tishu za mimea, tunahitaji kuchagua kit kwa mimea.Lysate katika kit inaweza kutatua kwa ufanisi matatizo ya oxidation rahisi ya polyphenols na kujitenga kwa misombo ya polysaccharide na asidi ya nucleic.
(Kwa uchimbaji wa RNA wa mmea wa polysaccharide polyphenol, bidhaa zinazopendekezwa:
(1) Maganda, majimaji, mbegu, majani, n.k. ya mmea yanapaswa kusagwa kikamilifu kwenye chokaa.Wakati wa kusaga, nitrojeni kioevu inapaswa kujazwa kwa wakati ili kuzuia kuyeyuka kwa sampuli.Sampuli ya ardhi inapaswa kuongezwa haraka kwa lysate na kutikiswa ili kuepuka uharibifu wa RNA.
(2) Kwa sampuli zenye nyuzinyuzi nyingi kama vile mchele na majani ya ngano, kiasi cha uchimbaji kinapaswa kupunguzwa ipasavyo, la sivyo usagaji wa tishu na uchanganuzi hautakamilika, na hivyo kusababisha mavuno kidogo ya RNA iliyotolewa.
(3) Kwa tishu za mmea zilizo na maji mengi, kama vile tunda la komamanga, tunda la tikiti maji, tunda la pichi, n.k., saizi ya sampuli inapaswa kuongezwa ipasavyo (100-200 mg ni ya hiari).
(4) Tishu za mmea, kama vile majani ya mmea, rhizomes, matunda magumu na vifaa vingine kwa ujumla hupendekezwa kutumia nitrojeni ya maji kupaka viungo kwenye chokaa, na kisha kuendelea na hatua ya uchimbaji.Homogenizers ya kawaida ya tishu inaweza kuwa na ufanisi katika homogenizing ya tishu za mimea, na kwa ujumla haipendekezi.
5. Tahadhari kwa uchimbaji wa RNA
(1) Sampuli za tishu zinapaswa kuwa safi iwezekanavyo ili kuzuia kuganda na kuyeyusha mara kwa mara.
(2) Tishu inapaswa kusagwa kikamilifu wakati wa uchimbaji, na kiasi cha tishu haipaswi kuwa kidogo sana, achilia mbali sana.
(3) Wakati wa kutosha wa incubation unapaswa kutolewa baada ya kuongeza lisaiti ili kusaga sampuli kikamilifu.
(4) Unapotumia mbinu ya Trizol kwa uchimbaji, kanuni ya kunyonya chembe cha nguvu zaidi baada ya kuweka tabaka ni "pendelea kuvuta pumzi kidogo kuliko kuvuta zaidi", na lazima isitoe kwenye safu ya kati, vinginevyo itasababisha uchafuzi mkubwa wa DNA ya jeni.
(5) Wakati wa kuosha, kioevu cha kuosha kinapaswa kupenya kikamilifu kuzunguka ukuta wa bomba ili kuhakikisha kuosha kabisa.
(6) Kwa njia ya uchimbaji wa safu, pamoja na kutenganisha safu baada ya kuosha, safu ya utangazaji inapaswa pia kuwekwa kwenye benchi iliyo safi kabisa na kupulizwa kwa dakika 5-10 ili kuyeyusha kikamilifu kutengenezea kikaboni hadi ukavu.
(7) Wakati wa kufafanua mwisho wa mbinu ya safu, baada ya kuongeza maji ya DEPC, inapaswa kuingizwa kwa dakika 3-5, au maji ya DEPC yanapaswa kuwashwa hadi 60 ° C mapema ili kuongeza mavuno ya elution.Katika njia ya jadi ya upasuaji wa Trizol na unyesheshaji wa isopropanol, RNA ya mwisho inayeyushwa katika maji ya DEPC, kwa hivyo wakati unaofaa unapaswa kutolewa kwa kufutwa, na sehemu ya chini ya bomba la centrifuge inapaswa kupulizwa mara kwa mara kwa ncha ya bomba.
3 Three Sababu na suluhu za ukolezi mdogo wa RNA/ubora duni
1. Mavuno ni kidogo sana
Sampuli iliyotolewa ni ya chini sana, jumla ya kiasi haitoshi, au sampuli iliyotolewa ni nyingi na lysis haijakamilika;tishu au seli za ubora unaofaa zitumike kwa uchimbaji, matibabu ya awali ya sampuli lazima yafanyike vizuri, na lysis inapaswa kutosha.
2. Mabaki ya jenomu
Wakati wa kuchimba kwa njia ya Trizol, wakati kiotomatiki kinapoingizwa kwenye safu ya kati baada ya kuweka tabaka, uchafuzi mkubwa wa jenomu utasababishwa;utunzaji wa ziada unapaswa kuchukuliwa wakati wa kuweka safu ili kuzuia kunyonya kwenye safu ya kati.Ikiwa mbinu ya safu wima inatumiwa kwa uchimbaji, seti iliyo na DNase I inaweza kuchaguliwa kwa uchimbaji.Asidi ya nukleiki inayotangazwa kwenye utando huchuliwa moja kwa moja na DNase I, ambayo inaweza kupunguza sana mabaki ya DNA.
3. Uharibifu wa RNA
Inaweza kuwa uharibifu wa sampuli iliyotolewa yenyewe, au uharibifu unaosababishwa wakati wa mchakato wa uchimbaji;kadiri inavyowezekana, sampuli mpya zitumike kwa uchimbaji wa RNA, na sampuli zilizokusanywa zinapaswa kuhifadhiwa kwenye nitrojeni kioevu au -80°C kwenye jokofu kwa wakati, na kufungia mara kwa mara na kuyeyusha kunapaswa kuepukwa.Vidokezo vya bure vya RNase/DNase, mirija ya centrifuge na vifaa vingine vinapaswa kutumika katika mchakato wa uchimbaji wa RNA.Mchakato wa uchimbaji unapaswa kuwa haraka iwezekanavyo.RNA iliyotolewa inapaswa kuwekwa kwenye sanduku la barafu na kuhifadhiwa kwa -80 kwa wakati.Ikiwa RNA iliyotolewa inahitaji kugunduliwa na electrophoresis ya gel, electrophoresis inapaswa kufanywa mara baada ya uchimbaji, na buffer ya electrophoresis inapaswa kubadilishwa na mpya iliyoandaliwa.
4. Mabaki ya chumvi na kikaboni kutengenezea
Vitendanishi vya uchimbaji vina chumvi ya phenol na guanidine, na suluhisho la kuosha lina ethanol.Wakati wa mchakato wa uchimbaji, lysate haikufyonzwa kabisa na kutupwa, na suluhisho la kuosha halikukaushwa kikamilifu.Chumvi zilizobaki na vimumunyisho vya kikaboni ni hatari kwa unukuzi unaofuata na PCR.Viwango tofauti vya kuzuia, hivyo lysate ya tishu inapaswa kuondolewa kikamilifu wakati wa mchakato wa uchimbaji, na kuosha inapaswa kutosha ili kuta za jirani za tube ziweze kuosha.Kwa kuongeza, bomba hutolewa na kupigwa ni hatua ya lazima, ambayo itapunguza zaidi mabaki ya suala la kikaboni.
Kwa habari zaidi kuhusu uchimbaji wa RNA, tafadhali fuata tovuti yetu:
www.foreivd.com kwa habari zaidi.
Muda wa kutuma: Dec-01-2022
