Fluorescence quantitative PCR (pia inajulikana kama TaqMan PCR, ambayo hapo awali inajulikana kama FQ-PCR) ni teknolojia mpya ya upimaji wa asidi ya nukleiki iliyotengenezwa na PE (Perkin Elmer) nchini Marekani mnamo 1995. Teknolojia hii inategemea PCR ya kawaida kwa kuongeza vichunguzi vilivyo na lebo ya umeme.Ikilinganishwa na PCR inayonyumbulika, FQ-PCR ina faida nyingi za kutambua utendaji wake wa kiasi.Makala haya yananuia kuelezea kwa ufupi sifa, kanuni, mbinu na matumizi ya teknolojia.
1 Vipengele
FQ-PCR sio tu ina unyeti mkubwa wa PCR ya kawaida, lakini pia kwa sababu ya utumiaji wa vichunguzi vya umeme, inaweza kugundua moja kwa moja mabadiliko ya ishara ya umeme wakati wa ukuzaji wa PCR kupitia mfumo wa upitishaji wa picha ili kupata matokeo ya kiasi, ambayo inashinda mapungufu mengi ya PCR ya kawaida, kwa hivyo pia ina umaalumu wa juu wa mseto wa DNA na teknolojia ya mseto wa juu.
Kwa mfano, bidhaa za jumla za PCR zinahitaji kuzingatiwa na electrophoresis ya gel ya agarose na upakaji wa bromidi ya ethidiamu na mwanga wa ultraviolet au kwa electrophoresis ya gel ya polyacrylamide na rangi ya fedha.Hii haihitaji tu vyombo vingi, lakini pia inachukua muda na jitihada.Madoa yaliyotumika Ethidium bromidi ni hatari kwa mwili wa binadamu, na taratibu hizi ngumu za majaribio hutoa fursa za uchafuzi wa mazingira na chanya za uwongo.Hata hivyo, FQ-PCR inahitaji tu kufungua kifuniko mara moja wakati wa upakiaji wa sampuli, na mchakato unaofuata ni operesheni ya bomba iliyofungwa kabisa, ambayo haihitaji usindikaji wa baada ya PCR, kuepuka vikwazo vingi katika shughuli za kawaida za PCR.Jaribio kwa ujumla hutumia kiendesha baisikeli cha joto cha ABI7100 PCR kilichoundwa na kampuni ya PE.
Chombo hiki kina sifa zifuatazo: ① Utumizi mpana: Inaweza kutumika kwa ukadiriaji wa bidhaa za DNA na RNA PCR, utafiti wa usemi wa jeni, utambuzi wa pathojeni na uboreshaji wa hali za PCR.② Kanuni ya kipekee ya upimaji: Kwa kutumia vichunguzi vilivyo na lebo ya umeme, kiasi cha umeme kitajilimbikiza pamoja na mzunguko wa PCR baada ya msisimko wa leza, ili kufikia madhumuni ya kukadiria.③ Ufanisi wa juu wa kufanya kazi: Kizunguzungu cha joto cha 9600 PCR kilichojengwa ndani, kompyuta ilidhibitiwa kwa saa 1 hadi 2 ili kukamilisha ukuzaji na ukadiriaji wa sampuli 96 kiotomatiki na sawia.④ Hakuna haja ya gel electrophoresis: Hakuna haja ya kuondokana na electrophoresis sampuli, tumia tu uchunguzi maalum ili kutambua moja kwa moja kwenye bomba la majibu.⑤Hakuna uchafuzi wa mazingira katika bomba: Tube ya kipekee ya athari iliyozingirwa kikamilifu na mfumo wa upitishaji umeme hupitishwa, kwa hivyo hakuna haja ya kuwa na wasiwasi kuhusu uchafuzi wa mazingira.⑥Matokeo yanaweza kuzaliana tena: masafa yanayobadilika ya kiasi ni hadi oda tano za ukubwa.Kwa hiyo, tangu teknolojia hii iliendelezwa kwa ufanisi, imethaminiwa na watafiti wengi wa kisayansi na imetumika katika nyanja nyingi.
2 Kanuni na mbinu
Kanuni ya kazi ya FQ-PCR ni kutumia 5′→3′ shughuli ya exonuclease ya kimeng'enya cha Taq ili kuongeza uchunguzi wenye lebo ya umeme kwenye mfumo wa athari ya PCR.Uchunguzi unaweza kuchanganywa haswa na kiolezo cha DNA kilicho katika mfuatano wa kwanza.Mwisho wa 5 wa uchunguzi umeandikwa jeni la uzalishaji wa fluorescence FAM (6-carboxyfluorescein, kilele cha uzalishaji wa fluorescence katika 518nm), na mwisho wa 3 umeandikwa na Kikundi cha kuzima cha fluorescence TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, 3 fosfori ili kuzuia uchunguzi kutoka kwa kupanuliwa wakati wa ukuzaji wa PCR.Wakati uchunguzi unabakia, kikundi cha kuzima hukandamiza utoaji wa fluorescence wa kikundi kinachotoa.Mara tu kikundi kinachotoa moshi kinapotenganishwa na kikundi cha kuzima, kizuizi huinuliwa, na msongamano wa macho kwa 518nm huongezeka na hugunduliwa na mfumo wa kugundua umeme. Katika awamu ya urekebishaji upya, uchunguzi huchanganywa na DNA ya kiolezo, na kimeng'enya cha Taq katika awamu ya upanuzi husogea pamoja na kiolezo cha upanuzi cha DNA.Wakati probe imekatwa, athari ya kuzima hutolewa na ishara ya fluorescent inatolewa.Kila wakati template inakiliwa, probe hukatwa, ikifuatana na kutolewa kwa ishara ya fluorescent.Kwa kuwa kuna uhusiano wa moja kwa moja kati ya idadi ya fluorophores iliyotolewa na idadi ya bidhaa za PCR, mbinu hii inaweza kutumika kuhesabu kwa usahihi template.Chombo cha majaribio kwa ujumla hutumia kizunguzungu cha joto cha ABI7100 PCR kilichoundwa na kampuni ya PE, na baisikeli zingine za joto pia zinaweza kutumika.Ikiwa mfumo wa mmenyuko wa aina ya ABI7700 unatumiwa kwa jaribio, baada ya majibu kukamilika, matokeo ya kiasi yanaweza kutolewa moja kwa moja kupitia uchambuzi wa kompyuta.Ikiwa unatumia baisikeli zingine za joto, unahitaji kutumia kigunduzi cha umeme ili kupima mawimbi ya umeme katika bomba la majibu kwa wakati mmoja ili kukokotoa RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ inawakilisha uwiano wa ukubwa wa luminescence ya kikundi cha utoaji wa umeme wa sampuli ya tube kwa nguvu ya luminescence ya kikundi cha kuzima, RQ- inawakilisha uwiano wa mbili katika tube tupu, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) inawakilisha kiasi cha usindikaji wa data ya data ya PCquarecence.Kutokana na kuanzishwa kwa probes za fluorescent, maalum ya jaribio imeboreshwa kwa kiasi kikubwa.Muundo wa uchunguzi unapaswa kukidhi masharti yafuatayo kwa ujumla: ① Urefu wa kichunguzi unapaswa kuwa takriban besi 20-40 ili kuhakikisha umaalum wa kuunganisha.②Maudhui ya besi za GC ni kati ya 40% na 60% ili kuepuka kurudia kwa mfuatano wa nyukleotidi moja.③ Epuka mseto au kuingiliana na vianzio.④ Uthabiti wa kuunganisha kati ya uchunguzi na kiolezo ni mkubwa kuliko uthabiti wa kuunganisha kati ya kitangulizi na kiolezo, kwa hivyo thamani ya Tm ya kichunguzi inapaswa kuwa angalau 5°C juu kuliko thamani ya Tm ya kianzio.Kwa kuongeza, mkusanyiko wa uchunguzi, homolojia kati ya uchunguzi na mlolongo wa kiolezo, na umbali kati ya uchunguzi na kitangulizi vyote vina athari kwenye matokeo ya majaribio.
Bidhaa zinazohusiana:
China Muda Halisi PCR Easyᵀᴹ-Taqman Mtengenezaji na Msambazaji |Foregene (foreivd.com)
Muda wa kutuma: Oct-15-2021
